I Norovirus: un problema sempre più attuale

I Norovirus sono una tra le cause principali di gastroenteriti acute di origine non batterica nel mondo. Isolati e scoperti nel 1972, i Norovirus appartengono alla famiglia Caliciviridae; sono anche noti come virus di Norwalk, dal nome della città dell’Ohio centro di un’epidemia di gastroenterite in una scuola elementare nel 1968. I Norovirus sono un gruppo di virus privi di envelope, a singolo filamento di Rna positivo, di circa 7,5 Kb, comprendente tre open reading frames. Il primo ORF (ORF1) codifica un polipeptide, ORF2 codifica la proteina del capside virale (VP1) e ORF3 codifica una proteina strutturale minore (VP2). I Norovirus sono classificati in 6 genogruppi, GI-GVI. I genogruppi I, II e IV colpiscono l’uomo. Secondo una recente proposta per la nomenclatura, i genogruppi sarebbero ulteriormente suddivisi in almeno 38 genotipi (Kroneman A. et al., 2013).
I Norovirus sono stabili nell’ambiente e possono essere trasmessi in diversi modi: attraverso l’ingestione di alimenti e acqua contaminati, da persona a persona o attraverso l’ambiente. Determinare la via di trasmissione durante un’indagine epidemiologica è complicato, perché essa può avvenire simultaneamente attraverso diverse vie. Ad esempio, dopo un’iniziale introduzione primaria del virus attraverso l’alimento, può insorgere una trasmissione secondaria tra persone o attraverso l’ambiente. Un’altra complessità deriva dal fatto che anche la trasmissione alimentare può seguire diverse vie: l’alimento può essere contaminato all’origine o subire una contaminazione durante la manipolazione da parte di un operatore infetto. Per i Norovirus sono state riportate differenze genogruppo specifiche per quanto riguarda la persistenza ambientale, la sensibilità alla rimozione e inattivazione e la capacità di legarsi ai recettori (Verhoef L. et al., 2015).
Non coltivabili fino a poco tempo fa, i Norovirus hanno posto qualche problema diagnostico in passato. Fino a qualche anno fa, infatti, era possibile identificarli ma non quantificarli; inoltre, il Norovirus umano non era coltivabile, di conseguenza venivano utilizzati surrogati, quali il Norovirus murino, per valutarne la vitalità, mentre ora è possibile valutare se è vitale, in base alla capacità del Norovirus di legarsi agli antigeni contenuti nella mucina gastrica di maiale (Li X., Chen H., 2015).
Per stimare la proporzione di infezioni di origine alimentare causate dai Norovirus su scala mondiale, ci si può servire di diversi sistemi internazionali di sorveglianza epidemiologica, quali NoroNet, CaliciNet, EpiSurv. Il genotipo di Norovirus più frequentemente identificato nella trasmissione tra persone nelle epidemie di gastroenteriti è il Norovirus genotipo GII.4 (Kroneman A. et al., 2008; Verhoef et al., 2010).
Il Norovirus GI è invece il ceppo più comune identificato nel caso della trasmissione tramite l’acqua (Lysen M. et al., 2009), mentre nelle epidemie correlate al consumo di molluschi bivalvi sono stati riscontrati sia il genotipo GI che il GII (Bon F. et al., 2005; Kageyama T. et al., 2004).
In generale, gli alimenti più a rischio di contaminazione da Norovirus includono prodotti freschi quali ortaggi, frutta, frutti di bosco e MBV (Mathijs E. et al., 2012). Le ostriche sono le maggiori responsabili, tra i molluschi consumati, delle epidemie gastroenteriche (Bosch A. & Le Guyader S.F., 2010; Bellou M. et al., 2013). Studi recenti dimostrano che la percentuale di insorgenza di origine alimentare o da persona a persona differisce tra i genotipi: il genotipo GI ha più probabilità di essere di origine alimentare, mentre il GII.4 ha maggiore probabilità di essere trasmesso da persona a persona. Un recente studio sull’insorgenza del Norovirus negli Stati Uniti ha evidenziato come i genotipi GI.3, GI.6, GI.7, GII.3, GII.6, GII.12 sono quelli più frequentemente associati ad epidemie di origine alimentare (Verhoef L. et al., 2015). La trasmissione da persona a persona è stata calcolata tra il 62-84% di tutte le epidemie riportate (Vega E. et al., 2011, 2014).
Tra le epidemie da Norovirus, aventi una modalità sconosciuta di trasmissione, segnalate nei sistemi di sorveglianza tra il 2009 e il 2012, 193 di 1.332 casi (pari al 14,5%) potrebbero essere attribuiti al cibo. (Verhoef L. et al., 2015). Servendosi dei dati riportati nell’US CaliciNet, dal 2009 al 2013, Vega E. et al. (2014) conclusero che l’83,7% delle epidemie da Norovirus erano da attribuirsi alla trasmissione tra persone, mentre solo il 16,1% erano di origine alimentare. Il numero delle epidemie di ori­gine alimentare descritte per Norovirus è comunque sottostimato rispetto al numero reale. Inoltre la malattia da Norovirus è normalmente autolimitante, le complicazioni sono rare, e ciò probabilmente ne comporta un’ulteriore sottostima (Mathijs E. et al., 2012). Considerato che circa un’epidemia da Norovirus su sette è attribuibile al consumo di alimenti contaminati, la trasmissione di origine alimentare rappresenta un ambito importante su cui intervenire con misure preventive.

Trasmissione, sintomi, decorso e casistiche
Le infezioni causate da Norovirus si manifestano soprattutto in contesti comunitari, negli ospedali, nelle case di riposo, nelle scuole o, tipicamente, in ambienti confinati, come per esempio le navi da crociera. Il virus è altamente infettivo e sono sufficienti 10-100 virioni/g per scatenare la malattia. Data la loro persistenza nell’ambiente, i Norovirus sono difficili da controllare ed è quindi necessario applicare rigorose misure sanitarie per prevenirli e contenerli. La trasmissione può avvenire direttamente da persona a persona, per via oro-fecale o via aerosol, oppure tramite acqua o alimenti infetti. Il periodo di incubazione è variabile: Atmar R.L. et al. (2013) hanno riscontrato che esso varia da 20 a 50 ore, anche se può essere minore con elevate quantità di Norovirus. Inoltre la durata dei sintomi varia da 8 a 60 ore, tuttavia le persone infette possono continuare ad eliminare il virus fino a 55 giorni.
Nell’insorgenza delle epidemie, le infezioni da Norovirus GII superano in numero quelle da GI; il genotipo GII è stato riscontrato, infatti, nell’80% dei casi. Il genotipo GII.4 è responsabile della maggior parte dei casi associati alla trasmissione da persona a persona (Vega E. et al., 2014). Ottenere statistiche relative al numero delle gastroenteriti da Norovirus di origine alimentare è estremamente impegnativo poiché diversi fattori devono essere considerati. Lo studio di Scallan E. et al. (2011) ha stimato che negli USA i virus rappresentano il 59% delle malattie trasmesse dagli alimenti e che il Norovirus è responsabile del 99% di questi ultimi. I sintomi sono quelli tipici delle gastroenteriti e comprendono febbre, diarrea, nausea, vomito, crampi addominali, debolezza, mialgia e cefalea. Nonostante il decorso sia generalmente autolimitante e benigno, i dati riportano circa 15.000 ospedalizzazioni (26%, seconda causa di ricovero per tossinfezioni di origine alimentare) e 150 morti (11%, quarta causa di decesso per tossinfezioni di origine alimentare) all’anno negli USA. Lo studio di Wilhelm B. et al. (2015) riporta, nei Paesi industrializzati, 64.000 casi di diarrea da Norovirus che hanno richiesto il ricovero, 900.000 visite mediche tra i bambini e fino a 200.000 decessi di bambini sotto i 5 anni nei Paesi in via di sviluppo.
Usando i dati ottenuti dal Foodborne Disease Outbreak Surveillance System, è stato possibile fare alcune considerazioni generali:
la maggior parte dei casi associati agli alimenti non possono essere attribuiti ad un alimento specifico;
le epidemie da Norovirus umano sono causate più frequentemente da cibi elaborati piuttosto che da alimenti semplici;
le verdure fresche sono responsabili del 30-40% dei casi, seguite da frutta e nocciole (10-20%) e molluschi bivalvi (10-15%) (Moore M.D. et al., 2015).

Presenza del Norovirus nelle acque della laguna sud di Venezia e in Italia
La maggior parte dei metodi convenzionali di trattamento delle acque e dei reflui si sono dimostrati inefficaci nella rimozione completa e nell’inattivazione di virus enterici, rendendo l’acqua una delle principali fonti di esposizione umana al Norovirus (Ayukekbong J.A. et al., 2015). L’acqua dei fiumi dunque rischia di essere contaminata dai Norovirus in quanto riceve continuamente gli effluenti dagli impianti di trattamento delle acque di scarico. I depuratori sono ottimizzati per la rimozione dei batteri, mentre possono essere meno efficienti per la rimozione dei patogeni virali. Nello studio di Mathijs E. et al. (2012) le acque dei fiumi, usate per l’irrigazione, sono state analizzate per rilevare la presenza di Norovirus: quest’ultimo è stato riscontrato in tutti i campioni esaminati. La concentrazione dei Norovirus nelle acque dei fiumi varia notevolmente, così come il range di genotipi. In alcuni casi sono stati riscontrati contemporaneamente anche altri virus enterici quali rotavirus, enterovirus e adenovirus.
È stata inoltre osservata, in diversi studi, una variazione stagionale dei livelli di Norovirus, riscontrato più frequentemente in inverno e inizio primavera. Questa stagionalità è attribuibile probabilmente all’alta prevalenza di Norovirus nella popolazione umana durante l’inverno e al fatto che le basse temperature contribuiscono alla conservazione del virus (Mathijs E. et al., 2012).
Anche uno studio condotto sulle acque sotterranee italiane ha riscontrato Norovirus nel 15% delle sorgenti (Gabrieli R. et al., 2009). Così come nelle acque dei fiumi, anche nelle acque sotterranee è stato trovato un ampio range di genotipi.
La Tabella 1 riporta il prospetto dell’attività di monitoraggio (gennaio-giugno 2015) per la ricerca di Norovirus ed epatite A svolta dall’AULSS n. 14 di Chioggia su campioni di vongole veraci. Come si può notare, il 53% dei campioni è risultato positivo per Norovirus GI e il 27% dei campioni per Norovirus GII.
I molluschi bivalvi sono tra gli alimenti più frequentemente implicati nelle epidemie da Norovirus. Essendo organismi filtratori, se allevati in acque contaminate, tendono ad accumulare il virus (si pensa che il Norovirus si localizzi soprattutto nella ghiandola digestiva).
Il Norovirus è stato riscontrato negli allevamenti di molluschi bivalvi di tutto il mondo. Le misure di controllo per prevenire epidemie da Norovirus consistono nell’alta qualità delle acque di allevamento. Se le acque sono contaminate, devono essere prese misure specifiche per l’inattivazione del Norovirus o deve essere aumentata la depurazione per gestire il rischio associato all’insorgenza di gastroenteriti (Dore B. et al., 2010). Inoltre, deve essere aumentata la conoscenza dei pericoli associati al consumo di molluschi crudi (Sala M.R. et al., 2009).
Particolare attenzione dovrebbe essere posta sulle aree dedicate all’ostricoltura, poiché abitualmente le ostriche vengono consumate crude e rappresentano quindi un rischio maggiore per la trasmissione di Noro­virus. Sarebbe opportuno scegliere come aree di allevamento zone indenni da Norovirus, lontane quindi dalle foci dei fiumi e dai depuratori. Queste aree dovrebbero inoltre essere costantemente monitorate per la presenza di Norovirus.
In Italia uno studio condotto dal 2003 al 2011 su diversi prodotti della pesca e molluschi ha rilevato positività per Norovirus nel 4,1% dei campioni (Pavoni E. et al., 2013).
Il recente studio di Suffredini E. et al. (2014), atto a valutare la contaminazione virale dei molluschi bivalvi raccolti in Italia, ha esaminato per la ricerca qualitativa e quantitativa del Norovirus GI e GII (tramite RT-PCR) diverse specie di molluschi bivalvi raccolti in quattro regioni italiane, provenienti da aree di raccolta classificate sia A che B. I risultati dello studio mostrano come Norovirus sia presente in più della metà dei campioni; esso interessa, in misura diversa sia per la percentuale di contaminazione che per la diversa quantità rilevata, le aree di produzione classificate A (22,1%; 3,1x102 copies/g) da quelle classificate B (66,3%; 1,9x103 copies/g). Le diverse specie analizzate (Mytilus, Tapes/Ruditapes e Crassostrea), prelevate da aree di raccolta classificate B, mostrano una prevalenza di Norovirus rispettivamente del 70,3%, 66,0% e 47,8%.

Inattivazione dei Norovirus con raggi UV negli impianti di depurazione molluschi
L’irradiazione con raggi UV è ampiamente usata per la disinfezione dell’acqua potabile negli impianti di trattamento. I risultati promettenti nell’efficacia dei raggi UV nei confronti dei batteri e dei virus umani hanno aumentato l’interesse riguardo l’efficacia dei raggi UV sul Norovirus umano (Rönnqvist M. et al., 2013).
I raggi ultravioletti e l’ozono sono i disinfettanti più utilizzati durante i processi di depurazione dell’acqua. Il trattamento con raggi UV è efficiente, ha costi contenuti, comporta una semplice manutenzione e non interferisce con le proprietà organolettiche dell’acqua o dei molluschi; per questo è il metodo più usato in tutto il mondo.
Sebbene l’azione battericida dei raggi UV nell’acqua sia ben conosciuta, pochi studi hanno valutato l’efficacia del trattamento sull’acqua di mare per l’inattivazione di virus nelle vasche di depurazione (Garcia L.A.T. et al., 2015).
Calicivirus, come Murine Noro­virus e Feline Calicivirus, hanno una maggior resistenza al trattamento con raggi UV rispetto ai batteri, richiedendo una dose di approssimativamente 40 mJ/cm2 per ottenere un abbassamento di 4 log (Garcia L.A.T. et al., 2015; Park G.W. et al., 2011b; Duizer E. et al., 2004; Lee J. et al., 2008a).
Anche lo studio di Corrêa A. et al. (2012) conferma un abbassamento di 4 log del Murine Norovirus sottoposto a trattamento con raggi UV, dopo 24 ore di depurazione.
Le radiazioni ultraviolette nel range C (UV-C, 254 nm) e nel range B (UV-B, 280-320 nm) sono state utilizzate per valutare l’efficacia nell’inattivare diversi virus appartenenti alla famiglia Caliciviridae. Esponendo i Calicivirus a 29 mJ/cm2, è stata ottenuta una riduzione di 4 log. L’inattivazione dei Calicivirus attraverso vari metodi chimici e fisici dipende dalla matrice, dall’umidità e/o dal tempo di contatto. L’inatti­vazione (> 4 log) di Calicivirus avviene con UV-C ad una irradiazione in eccesso di 40 mJ/cm2 o con UV-B ad una irradiazione in eccesso di 60 mJ/cm2 (Nims R. & Plavsic M., 2013).
I limiti del trattamento UV dell’acqua di mare sono la torbidità e i sali disciolti. Questi fattori incidono sulla trasmissione dei raggi UV nella colonna d’acqua, riducendo di conseguenza la loro azione. Tuttavia è stato dimostrato che l’uso di filtri a sabbia, per rimuovere il particolato nell’acqua di mare, ne diminuisce la torbidità.
La stabilità del Murine Norovirus nell’acqua di mare senza trattamento con raggi UV può comunque essere influenzata dalla salinità. Una concentrazione elevata di sale porta all’inattivazione del Murine Norovirus, indicando che i Norovirus possono essere inattivati più velocemente nell’acqua di mare rispetto all’acqua dolce (Corrêa A. et al., 2012).

Inattivazione dei virus nelle acque di scarico dei depuratori
I virus enterici umani includono gli enterovirus, adenovirus, Norovirus, rotavirus e il virus dell’epatite A, e possono causare un ampio spettro di malattie e sintomi. Nonostante i possibili rischi per la salute pubblica, le acque di scarico dei depuratori vengono raramente monitorate per la ricerca dei virus enterici, mentre un indicatore batterico, come l’Escherichia coli, è un parametro richiesto per l’autorizzazione allo scarico e viene monitorato regolarmente. L’abbattimento degli indicatori batterici non rappresenta necessariamente la rimozione dei virus.
Nello studio di Francy D.S. et al. (2012) sono stati raccolti campioni da cinque impianti di trattamento delle acque reflue e analizzati per gli indicatori batterici, i coliformi e i virus enterici. Attraverso la qPCR o qRT-PCR sono stati riscontrati, nei campioni di acque reflue, adenovirus, enterovirus e Norovirus GI. Il Norovirus GII e il virus dell’epatite A non sono stati inclusi perché non rilevati in nessun campione.
Il Norovirus GI è stato rilevato con qRT-PCR in più della metà dei campioni di acque reflue trattate negli impianti con bioreattori a membrana, mentre non è stato rilevato in nessun campione sottoposto a disinfezione tramite raggi UV.
Un altro studio di Simmons et al. (2011) non ha rilevato Norovirus GI in nessun campione, rilevando invece Norovirus GII in 20 dei 32 campioni di acque reflue. Rilevare un genotipo di Norovirus al di sopra di un altro può essere dovuto all’andamento stagionale dei genotipi (Katayama H. et al., 2008) e alle differenze nel luogo in cui è stato condotto lo studio (Said M.A. et al., 2008).
Tra i parametri che influenzano la progettazione di un impianto di trattamento delle acque con UV hanno una notevole rilevanza alcune caratteristiche del liquido sottoposto al trattamento; tra queste la trasmittanza (ovvero il rapporto tra l’intensità dei raggi UV in uscita e quelli incidenti in un liquido).
Anche la trasmittanza dei quarzi in cui sono poste le lampade ha una importanza notevole. Sulla superficie di questi elementi si possono depositare residui organici o inorganici che progressivamente assorbono una parte della radiazione UV destinata alla disinfezione. I cicli di pulizia periodica dell’impianto provvedono a mantenere elevata la trasmittanza.
La torbidità dell’acqua è un altro fattore che influisce sull’efficacia dei raggi UV. Essa è dovuta alla presenza di particelle sospese nell’acqua che interferiscono con la trasmissione degli UV. Alcune particelle hanno la caratteristica di diffrangere la luce incidente e ne deviano quindi il percorso, ma non ne assorbono l’energia; la loro influenza sulle prestazioni è quindi minima. Altre particelle, invece, assorbono gli UV che ricevono, e quindi diminuiscono la trasmittanza dell’acqua. In generale, sono le particelle relativamente grandi (diametro tra 1 e 10 μm) ad avere una reale influenza sulle prestazioni dell’impianto. Valutare la torbidità del liquido è quindi molto importante negli impianti di trattamento dei reflui. Studi di laboratorio hanno stabilito che una torbidità inferiore a 5 NTU (Nephelometric Turbidity Unit) non ha significativi effetti sui trattamenti con UV. Poiché in genere nelle acque potabili la torbidità è intorno a 0,1 NTU, in tutti i processi di potabilizzazione questo parametro non viene considerato.
Nei trattamenti dei reflui con UV, invece, il problema può essere rilevante e per tale motivo negli impianti è previsto un prefiltraggio del liquido che abbassi il più possibile il contenuto dei solidi sospesi prima del trattamento con UV (ad esempio con filtri a sabbia). Ulteriori indagini potrebbero essere utili al fine di valutare l’efficacia reale dei raggi UV contro i Norovirus nei depuratori presenti in Veneto, in quanto l’apporto di acque da tali impianti può influire in modo sostanzioso sulla presenza di Norovirus e altri virus enterici in tutta la laguna di Venezia (Grafico 1).

Linee di indirizzo nell’UE e in altre zone nel mondo
Nel report annuale del Rapid Alert System for Food and Feed (RASFF) del 2014 è stato riportato un importante incremento delle notifiche (25) per Norovirus nei molluschi bivalvi (in gran parte attribuibile a 24 notifiche dal Vietnam) tanto da rientrare nella Top 10 number of notifications. Le indagini mostrarono che i molluschi bivalvi non venivano cotti in modo adeguato ad inattivare i patogeni, ma anche che l’origine del problema risiedeva nella scarsa qualità dell’acqua delle coste dove venivano raccolti. Nonostante l’argomento sia mol­to discusso e l’ultima notifica RASFF per Norovirus, ritrovato in ostriche francesi, risalga a pochi mesi fa (marzo 2015), l’Unione Europea non ha ancora preso dei provvedimenti in merito a questo problema emergente. Atteggiamenti diversi sono stati intrapresi dalla Nuova Zelanda e dagli Stati Uniti, dove non solo viene svolta un’attività di controllo e monitoraggio, ma, nel caso di positività, l’area di raccolta viene chiusa, vengono eliminate le fonti di contaminazione e, dopo aver atteso un periodo di 28 giorni per la Nuova Zelanda e 21 giorni per gli USA, l’area viene riaperta, a seguito di opportuni campionamenti.
La quantificazione del Norovirus è stata resa possibile solo negli anni più recenti. La Food Safety Authority of Ireland, nel dicembre 2013, ha posto dei limiti per poter reimmettere sul mercato le ostriche provenienti da un’area implicata in un’epidemia da Norovirus. La concentrazione di Norovirus nelle ostriche provenienti da quest’area, destinate al consumo umano diretto, deve essere inferiore a 200 cpg in due campioni consecutivi eseguiti a distanza di 24 ore. Le ostriche provenienti da quest’area, destinate invece al consumo umano dopo un trattamento di depurazione, possono essere reimmesse sul mercato solo dopo che l’OSA abbia dimostrato che il trattamento di depurazione le ha portate a concentrazioni di Norovirus inferiori a 200 cpg.
Nel giugno 2011, l’EFSA ha pubblicato la Scientific Opinion on Norovirus per aggiornare le attuali conoscenze sulla presenza e il controllo dei virus di origine alimentare. Viene raccomandato di concentrarsi su misure preventive per evitare la contaminazione virale, piuttosto che provare a rimuovere o inattivare i virus dall’alimento.
Con Nota del Ministero della Salute (Circ. Reg. Veneto 294917 del 16-07-2015), si evidenzia la necessità di indicare in etichetta la dicitura “da consumarsi previa cottura” nel caso in cui sia riscontrata positività per Norovirus nei molluschi bivalvi destinati alla commercializzazione. Un trattamento termico di 90°C per 90 secondi a cuore del prodotto è in grado di inattivare i Norovirus; ma quando queste condizioni vengono raggiunte durante il processo di cottura?
Lo studio di Toffan A. et al. (2013) ha valutato l’efficacia della cottura domestica nell’inattivare i Norovirus nei molluschi bivalvi. I risultati hanno dimostrato che 10 minuti di cottura, ad una temperatura di 100 °C per almeno 2 minuti, sono in grado di inattivare completamente i Norovirus (tali condizioni si verificano facendo cuocere i MBV per circa 5 minuti dopo l’apertura delle valve).
Anche alte pressioni idrostatiche (HHP) possono ridurre il titolo dei virus apportando modifiche pressoché irrilevanti alle caratteristiche delle carni. È stato dimostrato che una pressione di 600 MPa, applicata per 5 minuti ad una temperatura di 6°C, può inattivare completamente i Norovirus nelle ostriche (Leon J.S. et al., 2011; Ye M. et al., 2014).
Esaminando attentamente l’alta diffusione dei Norovirus e l’importanza che assumono in sanità pubblica per l’elevata infettività, le abitudini alimentari di consumare molluschi crudi o poco cotti e il rischio che un soggetto infetto rappresenta per le altre persone, è opportuno prevedere misure di controllo. Sarebbe utile a tal fine attuare azioni preventive: monitorare le aree di produzione dei molluschi bivalvi per valutare l’effettiva prevalenza del virus, individuare le aree a rischio e predisporre sistemi di depurazione più efficaci, nonché il preventivo trattamento dei reflui. Ulteriori studi dovrebbero essere condotti per valutare l’efficacia della riduzione ed inattivazione dei virus nelle diverse specie di molluschi dopo la depurazione.

Dott. Luciano Boffo
Medico Veterinario Consulente Sicurezza Alimentare

Dott.ssa Patrizia Buratti
Dirigente Veterinario AULSS n. 14 – Chioggia (VE)

Dott.ssa Irene Francescon
Borsista AULSS n. 14 – Chioggia (VE)

Dott. Mirco Volpin
Veterinario SAI AULSS n. 14 – Chioggia (VE)



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