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Il Pesce nr. 6, 2012

Rubrica: Indagini
Articolo di Magnabosco C. , Civettini M. , S. Cavallero , D’Amelio S. , Boffo L. , Mingarelli G. , Buratti P. , Giovanardi O. , Fortuna C.M. , Arcangeli G. ,
(Articolo di pagina 131)

Indagine sulla prevalenza di larve della famiglia Anisakidae in sardine e alici in Nord Adriatico

Introduzione

La famiglia Anisakidae rappresenta un gruppo omogeneo di Nematodi al-l’interno della super famiglia Asca-ridoidea, costituito da specie dipendenti da ospiti acquatici per il completamento del loro ciclo vitale. Gli anisakidae sono parassiti a distribuzione cosmopolita e vengono ritrovati nei mammiferi marini allo stadio adulto del loro ciclo biologico e allo stadio larvale in numerose specie ittiche e in cefalopodi. La presenza delle larve nei pesci destinati a uso alimentare rappresenta un problema economico, per la perdita di valore del pescato, e sanitario, perché l’uomo può entrare a far parte del ciclo biologico come ospite occasionale se ingerisce cefalopodi o pesci crudi, parzialmente cotti o sottoposti a trat-tamenti (salatura, marinatura, affumicatura) che non causino la morte delle larve eventualmente presenti nelle parti edibili. L’ingestione delle larve può provocare un’affezione nell’uomo, a carico del tratto gastrointestinale, nota come anisakidosi, che può causare anche forti reazioni allergiche.

Nonostante il primo caso umano di anisakidosi accertato sia stato osservato in Olanda nel 1955 da Straub (Van Thiel et al., 1960), uno dei paesi più colpiti, a causa delle abitudini alimentari, è il Giappone (Asami et al., 1965; Ishikura et al., 1993), ma sono presenti casi anche negli Stati Uniti d’America (Pinkus et al., 1975), in Spagna (Puente et al., 2008) e in Italia (D’Amelio et al., 1999; Maggi et al., 2000; Fumarola et al., 2009; Marzocca et al., 2009; Pampiglione et al., 2002). Misure preventive e un’adeguata attività sanitaria hanno recentemente arginato il fenomeno soprattutto in Oriente, dove è forte e radicata l’abitudine di consumare pesce crudo. Di tutte le specie che causano l’anisakidosi, le più frequenti nel-l’uo-mo sono Anisakis simplex s.l. e Pseudoterranova decipiens s.l., reperibili allo stadio larvale in numerose specie di pesci e cefalopodi; in particolare sembra che gli allergeni del complesso di specie A. simplex siano altamente termostabili e di con-seguenza responsabili di forti reazioni allergiche che possono sfociare in shock anafilattico, orticaria e angioedema (Audicana et al., 2002; Caballero e Moneo, 2004; Lopez Ser-rano et al., 2000; Perteguer et al., 2000; Valero et al., 2003).

I generi Anisakis e Pseudoterra-nova appartengono alla sottofamiglia Anisakinae, mentre il genere Hy-sterothylacium appartiene alla sot-tofamiglia Raphidascarinae; que-st’ultimo non sembra patogeno per l’uomo, ma Yagi et al. (1996) riportano la sua presenza in un caso di anisakidosi non invasiva.

Le specie appartenenti a questi generi sono diffuse anche nel Mare Adriatico. In Italia è molto diffuso il consumo di pesce azzurro (sardine e alici) marinato, spesso prodotto a livello casalingo a partire da pesce fresco e pertanto con il rischio di contrarre l’anisakidosi.

Anche se esistono ricette di marinatura efficaci per devitalizzare il parassita, queste vengono applicate a livello industriale, ma non a livello domestico (Arcangeli et al., 1996).

La possibilità di approfondire le conoscenze riguardo la prevalenza di tali parassiti, in particolare delle specie del genere Anisakis, consente di fornire al consumatore informazioni riguardo le zone dove è meno presente e, di conseguenza, di scegliere il pescato con minor rischio di contrarlo. Il Reg. CE 1224/2009, art. 58, sulla tracciabilità dei prodotti della pesca (con decorrenza dall’1 gennaio 2011) infatti obbliga alla dichiarazione precisa di provenienza del pescato. Lo scopo di questa indagine è stato quello di verificare la prevalenza di Anisakidae nel pesce azzurro, in una zona di pesca del Mare Adriatico settentrionale, e di identificare la specie di nematodi ritrovati.

 

Materiali e metodi

Le specie ittiche campionate nella presente indagine sono state Engraulis en-crasicolus (alice) e Sardina pilchardus (sardina). I campioni so-no stati prelevati con la modalità di pesca detta “volante” (unica rete centrale trainata da due pescherecci) in un’area del Nord Adriatico, antistante la laguna veneta, della superficie di circa 7.000 chilometri quadrati (vedi Figura 1).

Le indagini sono iniziate nel mese di settembre 2009 e sono continuate fino al mese di settembre dell’anno successivo, con la cadenza di prelievi riportata in Tabella 1 e 2. Sono stati analizzati in totale 29 campioni di alici e 22 campioni di sardine, dove ogni campione era costituito da 150 esemplari. Le specie ittiche sono state identificate morfologicamente secondo la chiave di Fischer et al. (1987). 

Successivamente veniva ispezionata la cavità celomatica di ogni soggetto al fine di reperire le larve di Anisakidae eventualmente presenti. Il pacchetto viscerale veniva asportato, deposto su superficie scura e ispezionato all’esame visivo.

Inoltre, da ogni soggetto venivano asportati 2 grammi di tessuto muscolare che, uniti ad altri fino a raggiungere 200 g, venivano posti in soluzione per la digestione artificiale così preparata: soluzione fisiologica (0,85 g NaCl per 100 ml acqua distillata), HCl 6 N (100 ml: aggiungere 29,2 ml di HCl 37% a 70,8 ml di acqua distillata), soluzione di pepsina (15 g pepsina con attività 1:10.000 NF secondo l’US National Formulary, sciolta in 750 ml di soluzione fisiologica). Dopo 12 ore la soluzione con il tessuto muscolare digerito veniva filtrata con filtro a maglie di 500 µm e le larve presenti prelevate e poste in alcool per l’identificazione morfologica (Jackson et al., 1981; Canada Food Directorate, 2006). È stato considerato solo il genere Anisakis, in quanto la metodica utilizzata non è affidabile per altri generi, come l’Hysterothylacium, che potrebbero essere degradati durante il processo di digestione.

Dopo l’ispezione del pacchetto viscerale, lo stesso veniva unito agli altri per l’esame di Baermann, storicamente usato per la ricerca di larve di strongili polmonari in ruminanti (Buchwalder, 1963; M. Eysker, 1997), e così modificato: i pacchetti viscerali venivano posti in sacchetto di garza, sospesi in soluzione fisiologica ed ivi lasciati a temperatura ambiente per una notte. Il giorno dopo venivano spillati dall’imbuto 10 cc di liquido, posti in piastra di Petri ed esaminati per presenza di larve. 

Per l’identificazione morfologica delle larve venivano usate le chiavi morfologiche proposte da Möller e Anders, 1986; Petter e Maillard, 1988; Shih e Jeng, 2002).

Le larve appartenenti al genere Anisakis e Hysterothylacium venivano quindi poste in alcool al 70% per la successiva identificazione mediante l’utilizzo di tecniche genetico-molecolari. Nello specifico, allo scopo di identificare i nematodi a livello di specie, è stata usata, come marcatore, una porzione del DNA ribosomale nucleare (ITS, spaziatori trascritti interni), formata da due regioni trascritte e non tradotte (ITS1 e ITS2) e una regione interna 5.8s codificante per la sub-unità ribosomale.

Viene prelevato un frammento di tessuto da utilizzare per l’estrazione del DNA, effettuata mediante l’utilizzo del Wizard® Genomic DNA purification kit (Promega) seguendo le istruzioni del protocollo. Il DNA genomico così ottenuto è servito da templato per l’amplificazione dell’intera regione, che misura circa 1.000 paia di basi. Il mix di reazione includeva 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mMMgCl2 (Bioline), 40 mM di mix di nucleotidi (Promega) e 50 pM/µl di primer forward NC5 (5-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCAT-3) e di primer reverse NC2 (5-TTAGTTTCTTCCTCCGCT-3) (Zhu et al., 2000), 1.0 U di BIOTAQ DNA Polymerase (Bioline) in un volume finale di 50 µl. La PCR è stata eseguita con i seguenti parametri: 10 minuti a 95°C (denaturazione iniziale), 30 cicli di 30 secondi a 95°C (denaturazione), 40 secondi a 52°C (annealing) e 75 secondi a 72°C (estensione), e uno step di allungamento finale di 7 minuti a 72°C. Un controllo negativo (senza DNA genomico) è stato incluso in ogni amplificazione. L’amplificazione di ogni campione è stata controllata utilizzando 5 µl di volume di reazione per la separazione mediante elettroforesi su gel di agarosio (1%), colorato con bromuro di etidio (10 mg/ml). Le bande sono state analizzate mediante l’utilizzo del trans illuminatore MULTI-ANALYST (v.1.1, Bio-Rad). Gli ampliconi positivi sono stati digeriti con due endonucleasi, HinfI e HhaI, che studi precedenti avevano dimostrato essere in grado di discriminare a livello di specie gli individui appartenenti al genere Anisakis (D’Amelio et al., 2000). I frammenti ottenuti sono stati separati mediante corsa elettroforetica in un gel di agarosio al 2%.

Le larve identificate a livello morfologico come appartenenti al genere Hysterothylacium, ritrovate tramite esame di Baermann, venivano esaminate alla prova biomolecolare in numero di 2 larve ogni pool, seguendo lo stesso procedimento adottato per l’analisi delle larve appartenenti al genere Anisakis.

 

Risultati

La digestione dei prodotti di PCR amplificati mediante l’utilizzo dei primers NC5-NC2 con gli enzimi di restrizione HinfI e HhaI ha evidenziato due patterns principali confermando la presenza di due specie di larve L3, identificate come: Anisakis pegreffi e Hysterothylacium aduncum. Nelle alici la prevalenza di Anisakis è stata pari a 25 larve in 4.350 alici esaminate, mentre Hysterothylacium ha mostrato una prevalenza pari a 1.247 larve L3 (vedi Tabella 1).

Nelle sardine la prevalenza di Anisakis è pari stata pari a 10 larve in 3.300 sardine esaminate, mentre Hysterothylacium ha mostrato una prevalenza pari a 1.456 larve L3 (vedi Tabella 2). In Tabella 3 viene riportato il dettaglio dei campioni positivi e relative percentuali.

Nelle sardine risulta una correlazione positiva tra numerosità di larve di Anisakis e Hysterothylacium e periodo di pesca, essendo queste concentrate nel periodo da giugno a settembre, mesi in cui le sardine sono anche leggermente più grandi, arrivando a 14-15 cm contro i 12-13 cm dei mesi autunno-invernali. Nelle alici non risulta tale correlazione.

 

Discussione

La bassa percentuale di Anisakis riscontrata sia in sardine che in alici è inferiore alle precedenti indagini di Fioravanti et al. (2003) che riportano, in Mare Adriatico centrale, percentuali di 3,1% per sardine e 4,1% per alici. Percentuali superiori sono descritte nel Mar Tirreno: in Campania il 7,1% in alici (Marrone et al., 2007), in Sicilia l’1,5% in sardine (Costa et al., 2010), Sardegna 13,3% in sardine (Piras et al., 2010), Liguria 21,8 % in alici (Rello et al., 2009). Da un punto di vista di caratterizzazione ecologica del Mare Adriatico, in relazione al ciclo dell’Anisakis, i dati ottenuti in questa ricerca riflettono più la distribuzione degli ospiti intermedi che quella degli ospiti finali. L’area di campionamento si riferisce, infatti, a una zona ove le specie carnivore di zooplancton sono molto più scarse rispetto al Mare Adriatico centrale e meridionale (Fonda Umani, 1996). Lo stesso vale per la ricchezza di biodiversità di cetacei, che vede il Mare Adriatico settentrionale caratterizzato dalla presenza di una sola specie residente e diffusa, il tursiope (Tursiops truncatus; Bearzi et al., 2008; Fortuna C.M., dati non pubblicati), mentre nel resto del bacino si trovano regolarmente i tursiopi, le stenelle (Stenella coeruleoalba), i grampi (Grampus griseus) e gli zifi (Ziphius cavirostris; Bearzi et al., 2004; Holcer et al., 2007; Fortuna C.M., dati non pubblicati). Queste diverse distribuzioni sono spiegate dalle diverse caratteristiche dei due ecosistemi posti a confronto: un’area costiera neritica (Mare Adriatico settentrionale) e una “oceanica” profonda (Mare Adriatico centrale e meridionale), che certamente modellano le comunità di fauna marina, a tutti i livelli, inclusi i parassiti. È interessante notare che i soli casi dell’area adriatica di infestazioni da Anisakis sono stati registrati in Puglia, zona meridionale del Mare Adriatico (Maggi et al., 2000; Pampiglione et al., 2002). Le altre zone del Mar Mediterraneo dove sono state registrate percentuali maggiori d’incidenza di Anisakis, come ad esempio il Mare Ligure, il Golfo di Cadice e lo Stretto di Gibilterra, da un punto di vista di ecosistema marino assomigliano più al Mare Adriatico meridionale che a quello settentrionale (Mattiucci et al., 2004; Mattiucci et al., 2008; Rello et al., 2009). Un’altra ipotesi da prendere in considerazione potrebbe essere quella di una maggiore resistenza all’Anisakis dell’alice del Mare Adriatico settentrionale rispetto a quella del resto del Mar Mediterraneo. È infatti nota l’esistenza di una differenza genetica e morfologica tra le alici della zona oggetto di studio e quelle del restante Adriatico e Mar Mediterraneo in genere (Bembo et al., 1996; Kristoffersen e Magoulas, 2008). Questa ipotesi rimane ovviamente da valutare attentamente. Diversa considerazione per quanto riguarda l’Hysterothylacium, presente in elevata percentuale, praticamente in tutti i campioni di sardine e alici esaminati. In questo caso l’ospite definitivo è però diverso, e cioè vari teleostei predatori (Deardorff e Overstreet, 1980). L’esame ispettivo visivo per ri-cerca di Hysterothylacium, di dimensioni notevolmente ridotte rispetto ad Anisakis, si è rivelato per nulla sensibile.

L’utilizzo del metodo di Baermann modificato ha aumentato notevolmente la sensibilità della diagnosi nella ricerca sia di Anisakis sia di Hysterothylacium e se ne propone l’introduzione a livello di controllo nelle aziende ittiche. L’esame del tessuto muscolare attraverso la digestione artificiale è sempre stato negativo ed è da rimarcare che l’analisi del pesce veniva effettuata subito dopo lo sbarco, su prodotto freschissimo. Questo dato è in linea con altri lavori che sostengono che la migrazione avviene in fase post mortem (Wotten and Waddel, 1977; Kino et al., 1993). Ne deriva che, se il pesce freschissimo è subito eviscerato, il rischio di contrarre l’Anisakis è molto basso. Si consideri inoltre che la specie pegreffi è ritenuta meno invasiva delle mucose rispetto alla specie simplex, presente nell’Oceano Atlantico (Suzuki et al., 2010).

Anche se la prevalenza di Anisakis trovata è stata molto bassa, questo non deve esimere i produttori e i consumatori dall’applicazione delle indicazioni normative riguardo l’obbligo di bonifica dei pesci da consumare crudi, anche se l’utilizzo di pesce con bassa prevalenza diminuisce in generale il rischio di contrarre la parassitosi e di andare incontro a fenomeni allergici. Un precedente in Europa sull’individuazione di aree a basso rischio Anisakis è il caso del Mar Baltico, area marina chiusa dove esiste una popolazione di aringhe autoctona, Clupea arengus membras, ma nell’area non sono presenti i crostacei (Euphasiidae), ospiti intermedi di Anisakis, in questo caso specie simplex, e un solo ospite definitivo potenziale, la focena comune (Phocoena phocoena). Le aringhe del Baltico si infettano solo durante la migrazione in fase di deposizione nel Mare del Nord (Horbowy and Podolska, 2001). Nel caso dell’alto Adriatico, per poter mantenere le caratteristiche di area a basso rischio Anisakis, è invece necessario continuare un monitoraggio di alici e sardine, in quanto impreviste migrazioni di tali pesci potrebbero modificare l’attuale situazione epidemiologica.

 

C. Magnabosco

M. Civettini

G. Arcangeli

Istituto Zooprofilattico Speriment. delle Venezie, Legnaro (PD)


S. Cavallero

S. D’Amelio

Università La Sapienza Dipart. di Sanità Pubblica, Roma


L. Boffo

P. Buratti

AULSS n. 14 Servizi veterinari Chioggia (VE)


G. Mingarelli

O. Giovanardi

Libero professionista Specialista in controllo dei prodotti ittici (ISPRA Chioggia)


C.M. Fortuna

Istituto Super. per la Protezione e la Ricerca ambientale (ISPRA Roma)


Note

La bibliografia è disponibile presso gli autori. Lavoro eseguito con finanziamento della Regione Veneto – DGR n. 039/2009.

 
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