Il Pesce nr. 5, 2011

Valutazione dei parametri di sicurezza alimentare in Tapes decussatus e Cerastoderma spp. provenienti dal banco naturale della laguna di Corru S’Ittiri (OR)

Rubrica: La pagina scientifica

Articolo di Meloni D., Marceddu M., Consolati S.G., Lamon S., Ciulli S., Grodzky M., Mazza R., Mureddu A., Piras F., Mazzette R.,

(Articolo di pagina 116)

Introduzione


I molluschi bivalvi, per la loro capacità di filtrare rilevanti quantità di acqua (1,5 l/h, a 14-15°C; Battisti et al., 2006), sono in grado di trattenere fino al 90% delle particelle in essa sospese (Corrain et al., 2007). Tra queste possono essere inclusi anche agenti patogeni (virus, batteri) presenti nell’ambiente di allevamento, che i molluschi possono contribuire a trasmettere (Parisi et al., 2004; Battisti et al., 2006). Le zoonosi alimentari da consumo di molluschi bivalvi crudi o poco cotti sono infatti diffuse in tutto il mondo e la loro incidenza sembra in aumento. I - (NoV) rappresentano la causa più comune di gastroenterite umana causata dal consumo di molluschi, che sono in grado di concentrare i virus fino a 900 volte rispetto al contenuto riscontrabile nelle acque. In particolare gli episodi di infezione alimentare sarebbero causati dai genotipi GI e GII (Corrain et al., 2007; Comelli et al., 2008; Bosch et al., 2009; EFSA, 2011). I NoV causano un’infezione autolimitante, caratterizzata da sintomatologia gastrointestinale che presenta un tempo di incubazione medio di 36 ore, si protrae in genere per circa 48 ore e si risolve spontaneamente senza complicanze. 
Nonostante la gastroenterite virale sia considerata una patologia a basso tasso di mortalità (0,1%), l’incidenza annuale registrata in alcuni paesi rende rilevanti i costi economico-sociali e di sanità pubblica in generale. Peraltro l’assenza di rilievi epidemiologici puntuali fa supporre che il numero di casi noti rappresentino una sottostima di quelli reali, soprattutto in riferimento a forme di media o lieve entità che non prevedono il ricorso all’ospedalizzazione (FAO, 2008). Anche il virus dell’epatite A (HAV) rappresenta un’importante causa di infezione alimentare dovuta al consumo di molluschi crudi o poco cotti, cui si stima siano da attribuire il 70% delle infezioni da HAV registrate in Italia (FAO, 2008). Si tratta di infezioni caratterizzate da un lungo periodo di incubazione (in media 4 settimane), i cui principali sintomi sono rappresentati da febbre, mal di testa, nausea, vomito, diarrea, dolore addominale e ittero. Nonostante i sintomi siano più severi e le complicanze di maggiore durata rispetto ai NoV, il tasso di mortalità dell’HAV è inferiore, attorno allo 0,2% (FAO, 2008).
Tra i microrganismi patogeni coinvolti in episodi di infezione umana, connessi al contatto diretto con l’ambiente acquatico o all’ingestione di molluschi o acqua contaminati, rivestono interesse diverse specie appartenenti al genere Vibrio spp. (Caburlotto et al., 2011). La prevalenza di tali microrganismi nei molluschi risulta, sulla base dei dati bibliografici, molto varia, anche in relazione alla disomogeneità delle metodiche utilizzate, che differiscono principalmente per le temperature di isolamento adottate (da 20-25°C a 37°C). Recenti studi eseguiti in Italia segnalano prevalenze comprese tra il 45% (Parisi et al., 2004) e il 93% (Serracca et al., 2007). Le specie patogene di maggiore interesse sono Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus e Vibrio cholerae. Le prime due possono essere naturalmente presenti nell’ambiente acquatico costiero e negli estuari, mentre la presenza dei sierotipi responsabili del colera epidemico (O1 e O139) è più frequentemente associata alla contaminazione fecale delle acque (FAO, 2008). V. parahaemolyticus è il principale agente di gastroenterite nel Sud-Est asiatico, in particolare in Giappone (FAO, 2008). Nei paesi occidentali, inclusa l’Italia, sono stati descritti episodi sporadici di gastroenterite associata al consumo di molluschi non sufficientemente cotti o crudi (Croci et al., 2001; Lozano-Leon et al., 2003).
Le infezioni associate a V. vulnificus sono abbastanza sporadiche e si contraggono per il consumo di molluschi crudi (Wong et al., 2004, FAO, 2008) oppure per contatto diretto con acqua di mare o molluschi contaminati (Croci et al., 2001; Serracca et al., 2007). I casi di morte causata da consumo o manipolazione di alimenti contaminati da V. vulnificus sono relativamente frequenti nelle coste degli USA e interessano tra il 7 e il 25% delle infezioni per contatto diretto con acqua di mare e il 50% degli episodi legati a consumo di molluschi contaminati (FAO, 2008). Le infezioni sono più rare in Europa e in Italia.
In Sardegna, tra il 2000 e il 2001 si sono verificati 2 decessi per sepsi fulminante attribuiti a V. vulnificus in soggetti affetti da gravi epatopatie croniche, che avevano manipolato e/o consumato prodotti della pesca nei giorni precedenti ai sintomi (Madeddu et al., 2004).
V. cholerae è l’agente eziologico del colera, caratterizzato da sintomatologia gastrointestinale più o meno grave, che in caso di complicazioni può raggiungere tassi di mortalità del 50% (Luzzi, 2005). V. cholerae comprende due principali sierogruppi, O1 e O139, e oltre 190 sierogruppi non agglutinabili da antisieri O1 e O139, classificati nel loro insieme come V. cholerae non-O1 e non-O139 (FAO, 2008). V. cholerae O1 è stato associato a pandemie causate dal consumo di molluschi contaminati, sia in paesi in via di sviluppo, sia in quelli sviluppati, tra cui l’Italia (Croci et al., 2001). V. cholerae O139, in Europa, non è stato mai associato a casi autoctoni di colera, ma solo a un numero limitato di casi di importazione (Marino et al., 2005). Oltre a quelli citati, anche altri agenti patogeni possono essere rilevabili, seppure in numero limitato, nei molluschi bivalvi. Tra questi possono essere inclusi gli E. coli patogeni, comunemente non riscontrati nei prodotti della pesca, ma la cui presenza è stata documentata (E. coli VTEC ed ETEC) in molluschi raccolti in zone contaminate da reflui terrestri e liquami zootecnici (Duffy et al., 2004).
E. coli VTEC, prevalentemente O157, sono stati isolati in ambienti di allevamento zootecnico (Avery et al., 2004) dai quali possono essere trasferiti ai corsi d’acqua, soprattutto durante i periodi di elevate precipitazioni (Williams et al., 2008) e da questi diffusi alle aree costiere.
Ai fini del controllo delle zone di produzione, la normativa comunitaria (Reg. CE 2073/2005) prevede la determinazione, nei molluschi bivalvi vivi, di Salmonella spp. e di E. coli. Tuttavia, alcuni studi (Savichtcheva et al., 2006) hanno dimostrato che essi sono scarsamente predittivi della presenza dei vibrioni e di altri patogeni (E. coli O157). In Sardegna la maggior parte degli allevamenti di molluschi bivalvi ricade in zone di produzione di classe B (Meloni et al., 2010). Alcune di esse sono geo-referenziate all’interno di aree lagunari di notevole interesse bio-naturalistico, nelle quali si riscontra la presenza di banchi naturali di molluschi. In queste aree la determinazione dei parametri microbiologici rappresenta un valido strumento di valutazione indiretta dell’idoneità delle acque e dell’impatto esercitato dall’ambiente sulle caratteristiche igienico-sanitarie dei molluschi. Nel presente lavoro vengono ri-portati i risultati di un’inda-gi-ne, condotta nel 2010, allo scopo di valutare la presenza di alcuni contaminanti batterici e virali di interesse per la sicurezza e la salute dei consumatori in molluschi bivalvi raccolti presso il banco naturale della laguna di Corru S’Ittiri. Si trattava di molluschi appar-tenenti all’ordine Veneroidae, in particolare di vongole veraci (Tapes decussatus) e cuori (Cerastoderma spp.). La laguna è una zona di elevato pregio naturalistico situata nella provincia di Oristano, considerata a rischio per la presenza di inquinamento di origine agrozootecnica. Recentemente, in campioni provenienti dall’area di produzione denominata “Stagno di Corru S’Ittiri”, analizzati nell’ambito del Piano regionale di sorveglianza dei molluschi e classificazione delle acque (Attività congiunta tra Assessorato all’Igiene e Sanità e Assessorato dell’Agricoltura della Regione Sardegna), è stata riscontrata una concentrazione di E. coli superiore al limite previsto per le zone di classe B, per cui l’area è stata riclassificata come zona di classe C (RAS, Determinazione n.14447/Det/408 del 21-06-2011). La presente indagine è stata inoltre condotta in collaborazione con gli operatori impegnati nello sfruttamento e nella valorizzazione della molluschicoltura lagunare, interessati ad avere informazioni relativamente al rispetto dei criteri di sicurezza dei prodotti.

Materiali e metodi


Il sito di campionamento: 
la laguna di Corru S’Ittiri
La laguna di Corru S’Ittiri (Figura 1) è una zona di elevato pregio naturalistico: sito RAMSAR, sito NATURA 2000, tutela Piano Paesaggistico Regionale, Riserva Naturale ex LR 31/1989, è un’oasi di protezione faunistica e di cattura legata alla sosta e riproduzione di avifauna acquatica di interesse comunitario (www.apmolentargius.it). È situata nel settore meridionale del Golfo di Oristano, al confine con la vasta area bonificata di Arborea. Si estende per una superficie di 240 ettari e ha una profondità variabile da 40 cm a poco più di un metro. I fondali sono fangosi nella parte più interna, sabbiosi verso l’esterno. Le sue acque possono essere definite mesotrofiche, con presenza di inquinanti di origine agricola. A nord della laguna si trova una depressione di circa 70 ettari che funge da bacino di raccolta delle acque irrigue della bonifica di Arborea (www.apmolentargius.it). La laguna presenta una forma allungata in direzione NE-SW (coordinate 39°45'N, 08°32'E) e deve la sua origine alla presenza di una estesa freccia litorale, che si è sviluppata parallelamente alla linea di costa, determinando la formazione di una stretta insenatura (www.apmolentargius.it).
La striscia di terra che chiude la laguna è stata originata dalla corrente di deriva litorale che, scorrendo da nord verso sud, trasporta grandi quantità del materiale detritico immesso in mare dal fiume Tirso e lo disperde lungo l’intero arco centro-meridionale del Golfo di Oristano (www.apmolentargius.it).
La laguna mostra buone possibilità di ricambio idrico dal mare, presentando due comunicazioni dirette (www.apmolentargius.it). In essa si riconoscono tre zone o stazioni a salinità decrescente: la salinità della I stazione è sempre elevata, data l’ampia foce, mentre nelle altre due (II e III stazione) tende a diminuire progressivamente a causa dei canaletti di scolo dei terreni vicini e per il notevole apporto d’acqua dolce fornito dall’emissario Pauli Pirastru.

Al centro della laguna confluisce l’influenza del mare e delle acque dolci, che agiscono in relazione alle precipitazioni, alle maree e ai venti. Gli sbalzi stagionali sono notevoli in relazione alle condizioni meteorologiche e all’influenza delle attività di bonifica, in quanto nella laguna sboccano l’emissario e le acque che provengono dalla bonifica della piana di Arborea (De Angelis, 1949).

 

Il campionamento dei molluschi bivalvi

Il piano del campionamento prevedeva la raccolta, con frequenza stagionale, di molluschi bivalvi ap-partenenti alle specie Tapes de-cus-satus (vongola verace) e Cera-sto-derma spp. (cuore), presso i ban-chi naturali della laguna di Corru S’Ittiri. Sono stati complessivamente prelevati 30 campioni in 4 sedute di campionamento (A, B, C, D): Tapes decussatus (20 campioni, sedute di campionamento A-B-C-D) e Cerastoderma spp. (10 campioni, sedute di campionamento A-B). I molluschi venivano rapidamente trasportati in condizioni di refrigerazione presso i laboratori della sezione di Ispezione degli Alimenti di Origine Animale del Dipartimento di Biologia Animale dell’Università degli Studi di Sassari, per essere analizzati. La preparazione del campione da sottoporre ad analisi è stata effettuata secondo quanto indicato nelle norme di riferimento (EN/ISO 6887-32004 ed EN/ISO 7218:2007).


Analisi microbiologiche

a) Salmonella spp. (EN/ISO 6579: 2002);

b) Vibrio spp.: da ciascun campione veniva prelevata una aliquota di 25 g di polpa e liquido intervalvare, che veniva diluita, in rapporto 1/10, in 225 ml di Alkaline peptone water, addizionato dell’1% di NaCl. L’isolamento veniva effettuato mediante semina in piastre di Thiosulphate Citrate Bile Salt Sucrose Agar (TCBS Cholera medium), additivato di NaCl fino ad una concentrazione finale del 3% (iniziale 1%) e portato a pH 8,4. Le piastre venivano poste a incubare a 20°C per 72 ore (Serratore et al., 2007). Da ciascuna piastra di TCBS venivano prelevate 5 colonie, sviluppate con aspetto tipico, che venivano seminate in piastre di Chloride Trypticase Soy Agar, additivato di NaCl fino ad una concentrazione finale pari al 3% (TSAS), per essere successivamente sottoposte ai seguenti test di conferma e identificazione fenotipica del genere Vibrio spp. (Masini et al., 2006):

1) colorazione di Gram e valutazione morfologica;

2) test della catalasi;

3) test dell’ossidasi;

4) test dell’alofilia;

5) test di sensibilità al fattore vibriostatico O129;

6) caratteristiche di sviluppo in Kliger Iron Agar (KIA-S al 2% NaCl). Sono stati selezionati 75 ceppi, aventi un profilo fenotipico caratteristico del genere Vibrio spp., che sono stati sottoposti a identificazione di specie, mediante sistema API 20NE (biòMerieux) modificato (Croci et al., 2006);

c) Listeria monocytogenes (EN/ISO 11290-1:1996 e EN/ISO 11290-2:1998);

d) E. coli VTEC: un’aliquota pari a 10 g è stata sottoposta ad arricchimento selettivo in modified-Tryptone Soya Broth (m-TSB), contenente novobiocina [20 mg/l] e incubata a 37°C per 18-20 ore. Da ciascun brodo di arricchimento è stato effettuato uno screening molecolare rapido, mediante la metodica EU Food PCR Project modificata. Su 1 ml di ciascun campione veniva effettuata l’e-stra-zione del DNA, mediante le resine Chelex-100 (Bio-Rad) e l’amplificazione dei geni stx1 e stx2. I brodi risultati positivi allo screening molecolare sono stati sottoposti a separazione immunomagnetica (IMS) manuale, impiegando le Dynabeads anti-E. coli specifiche per i sierotipi ricercati: O157, O26, O103, O111 e O145. Da ciascun complesso Dynabeads-microrganismo è stata effettuata la semina sui seguenti terreni: CT-SMAC (agar cefixime tellurite sorbitolo di MacConkey) per la ricerca di O157, CT-RMAC (agar cefixime tellurite ramnosio di MacConkey) per O26 ed EHLY agar per i sierogruppi O103, O111 e O145. Le piastre sono state incubate a 37°C per 24 ore. Gli isolati con caratteristiche tipiche venivano sottoposti a identificazione fenotipica con il sistema API 20E (biòMerieux); inoltre su tutti gli isolati risultati E. coli alle prove fenotipiche è stata eseguita una PCR multiplex per la ricerca dei geni stx1, stx2, hlyA ed eae (Paton e Paton, 1998).


Analisi virologiche

Norovirus GI e GII: la ricerca dei NoV è stata eseguita presso il Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie dell’Università degli Studi di Bologna su 20 campioni di epatopancreas congelato (–20°C), prelevato da Tapes decussatus. Sono stati costituiti pool di epatopancreas trattati con la Proteinase K, al fine di digerire il tessuto analizzato e liberare la componente virale. L’ estrazione del RNA è stata effettuata con un kit commerciale. La ricerca del virus è stata condotta mediante RT-PCR one-step, utilizzando i primers JV12-JV13 (Vinjé e Koopmans, 1996), che amplificano per un frammento di 326 bp in NoV di genotipo GI e GII. Successivamente, è stata condotta una caratterizzazione preliminare utilizzando due seminested-PCR specifiche per i genogruppi GI e G II (Boxman et al., 2006; Green et al., 1998).


Risultati


Parametri microbiologici

I risultati relativi alla determinazione dei parametri microbiologici di sicurezza nei molluschi bivalvi sono riportati nella Tabella 1 e nella Figura 2.

a) Salmonella spp.: non è stata rilevata in nessuno dei campioni esaminati.

b) Vibrio spp: la prevalenza è risultata elevata (90%), indipendentemente dalla tipologia di molluschi esaminata e dal periodo di campionamento. I livelli di contaminazione (media ± d.s.) sono risultati superiori (3,19 ± 1,07 log10 ufc/g) nei campioni di cuori (Cerastoderma spp.), seppure riferiti a due sole sedute di campionamento, rispetto a quelli di vongola verace (Tapes decussa-tus), prelevati nel corso di 4 campionamenti (2,84 ± 0,31 log10 ufc/g). Per quanto riguarda i risultati delle prove di identificazione dei ceppi di Vibrio spp., il 22% (n. 17) è risultato non identificabile, mentre il 48% (n. 36) è risultato appartenere al genere Vibrio spp.. Sono state in particolare identificate le specie V. vulnificus (98%) e V. alginolyticus (2%). I restanti ceppi (n. 22) sono risultati: Moraxella spp. (24%); M. haemolytica/P. trehalosi e P. multocida (18%); B. vescicularis e P. damselae (14%); Radiobacter spp., W. virosa / E. brevis e P. pneumotrofica (4%). Le difficoltà incontrate nell’identificazione fenotipica dei ceppi confermano la necessità, già segnalata, della messa a punto di metodi più affidabili e standardizzati, basati su tecniche biomolecolari (Croci et al., 2001; Masini et al., 2006).

c) Listeria monocytogenes: Listeria spp. è stata riscontrata nel 40% dei campioni di cuori (Cerastoderma spp.) e nel 55% di vongola verace (Tapes decussatus). Listeria monocytogenes è stata riscontrata occasionalmente in un campione di cuori (campionamento B, maggio) e in uno di vongole veraci (campionamento A, marzo). Complessivamente, sono stati isolati 22 ceppi appartenenti al genere Listeria spp. che sono risultati appartenere alle seguenti specie: L. ivanovii (41%), L. welshimeri (18%), L. innocua (14%), L. seeligeri (9%), L. grayi (9%) e L. monocytogenes (9%).

d) E. coli VTEC: mediante screening molecolare rapido, è stata riscontrata una prevalenza di E. coli VTEC nel 6,6% dei campioni analizzati, relativi a due differenti campioni, di cui uno di cuori e uno di vongole veraci, prelevati nel corso della medesima seduta di campionamento (B). Dai successivi test eseguiti sui brodi risultati positivi allo screening molecolare (separazione immunomagnetica manuale, semina su CT-SMAC, CT-RMAC ed EHLY agar) sono stati complessivamente isolati 10 presunti E. coli; in particolare da:

1) CT-SMAC: n. 2 O157;

2) CT-RMAC: n. 2 O26;

3) EHLY agar: n. 2 O103, n. 2 O145, n. 2 O11.

Tutti gli isolati sono risultati E. coli. La caratterizzazione molecolare effettuata mediante PCR multiplex ha evidenziato un profilo di patogenicità completo (stx1+, stx2+, eae+, hlyA+) nel DNA estratto dai brodi di arricchimento, risultati positivi al precedente screening preliminare. Viceversa, i ceppi isolati in seguito a IMS sono risultati negativi per tutti i geni di virulenza ricercati.


Parametri virologici

Complessivamente la presenza di NoV è stata rilevata in 5 campioni (25%) di vongole veraci, prelevati nel corso del campionamento A e B (a marzo e maggio). Il genotipo GI è stato riscontrato nel 10% dei campioni, mentre la prevalenza del GII è risultata superiore, pari al 25%. Quest’ultimo genotipo è responsabile della maggior parte delle infezioni, ma recenti dati epidemiologici documentano una predominanza di ceppi GI in focolai di gastroenterite (Comelli et al., 2008). Solamente 2 campioni sono risultati positivi ad entrambi i genotipi.


Conclusioni

La presente indagine costituisce un contributo pratico all’acquisizione di dati relativi ai parametri di sicurezza di molluschi bivalvi dell’ordine Veneroidae (Tapes decussatus e Cerastoderma spp.), raccolti presso la laguna di Corru S’Ittiri (OR), che dimostrano l’importanza del ruolo di sentinelle biologiche svolto da questi organismi filtratori prelevati da banchi naturali di zone umide.

I risultati del lavoro hanno evidenziato caratteristiche microbiologiche ritenute tipiche dei molluschi raccolti in aree lagunari caratterizzate da elevate percentuali di salinità. In particolare trova conferma la problematica connessa alla capacità di accumulo, da parte di questi organismi, di E. coli VTEC, dei vibrioni patogeni (V. vulnificus e V. alginolyticus) e virus (NoV GI e GII), che continuano a rivestire notevole importanza per la salute dei consumatori. Attualmente nel Reg. (CE) 2073/2005 sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari non viene prevista, tra i criteri di sicurezza, la determinazione di E. coli VTEC, dei vibrioni patogeni e dei NoV nei prodotti della pesca.

I risultati hanno evidenziato che i molluschi possono essere contaminati da E. coli VTEC e suggeriscono la presenza del rischio di inquinamento di origine agro-zootecnica nella zo-na considerata, che funge anche da bacino di raccolta di acque di bonifica.

La scarsa prevalenza di VTEC nei molluschi esaminati potrebbe essere correlata al basso numero di questi patogeni nell’ambiente costiero, alla presenza di una flora batterica competitiva e anche alla ridotta vitalità in vitro dei microrganismi rispetto all’ambiente marino (Gourmelon et al., 2006). Lo screening rapido mediante PCR ha permesso di individuare la presenza/assenza di VTEC direttamente sulle matrici.

Tuttavia, la difficoltà di isolamento dei ceppi nei terreni selettivo-differenziali evidenzia la necessità di ottimizzare ulteriormente il protocollo operativo, al fine di ridurre le problematiche correlate ad alcuni fattori che possono interferire sulla vitalità e sulla capacità di sopravvi-venza e sviluppo dei ceppi. La presenza dei NoV nei molluschi non è in genere correlata con la presenza dei batteri di origine fecale; infatti alcuni autori hanno dimostrato che in acque particolarmente inquinate, la presenza dei virus è molto scarsa a causa dell’azione competitiva esercitata dai batteri (Suffredini et al., 2008).

Il riscontro nei molluschi di NoV appartenenti ai genotipi GI e GII, che sono stati coinvolti in episodi di infezione umana, assume un importante significato sanitario, in relazione alla capacità di tali virus di resistere nell’ambiente, in presenza di condizioni favorevoli, per periodi più o meno lunghi. Infatti, nella laguna oggetto dell’indagine, si potrebbero verificare eventi che determinano l’aumento del rischio di contaminazione virale, tra i quali piogge abbondanti (nella zona gli sbalzi stagionali sono notevoli), che possono provocare la tracimazione di liquami non ancora depurati, o inefficienze nei sistemi di depurazione, che aumentano la dispersione virale nell’ambiente.

D. Meloni
M. Marceddu
S.G. Consolati
S. Lamon
R. Mazza
A. Mureddu
F. Piras
R. Mazzette

Dipartimento di Biologia Animale, Università degli Studi di Sassari

S. Ciulli
M. Grodzky

Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie
Università degli Studi di Bologna


Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare il Consorzio Cooperativa riunita della Pesca di Marceddì, per il supporto alle attività di campionamento e la fornitura dei campioni necessari alla ricerca, e il dott. Paolo Merella, del Dipartimento di Biologia Animale dell’Università degli Studi di Sassari, per aver concesso la pubblicazione delle fotografie.


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