Il Pesce nr. 5, 2010

Valutazione dell’efficacia dei sistemi di depurazione nei confronti di E. coli, Salmonella spp. e Vibrio spp. in mitili allevati nel golfo di Olbia

Rubrica: La pagina scientifica

Articolo di Mazzette R., Virgilio S., Piras A., Tempesta A., Serra S., Sferlazzo G., Pisanu M., Mureddu A., Meloni D.,

(Articolo di pagina 165)

Introduzione

L’Italia è il terzo produttore europeo di molluschi eduli lamellibranchi, dopo Spagna e Francia (Irepa, 2007). Nel 2005 sono state prodotte circa 180.000 tonnellate, di cui: 100.000 t di mitili (Mytilus galloprovincialis); 40.000 t di vongole veraci (Tapes decussata e Tapes philippinarum); 30.000 t di vongole (Venus gallina). La molluschicoltura è la principale voce produttiva dell’acquacoltura nazionale: nel 2006, il 70,6% della produzione totale da acquacoltura (oltre 170.000 t) proveniva da allevamenti di molluschi e, in particolare, il comparto della mitilicoltura incideva per il 73% (oltre 125.000 t). Inoltre, su 979 impianti di acquacoltura censiti nel 2005 dall’Idroconsult, ben 442 riguardavano la molluschicoltura (Ismea, 2007). Oltre il 40% degli impianti operanti nel settore dell’acquacoltura è localizzato in Veneto, seguito dalla Liguria (che vanta il maggior numero di impianti di mitilicoltura), la Puglia, l’Emilia-Romagna, la Campania, il Friuli Venezia Giulia e la Sardegna.

Le vongole sono prevalentemente prodotte in Veneto e in Emilia-Romagna, mentre la produzione di mitili è più tipica delle regioni adriatiche e tirreniche, con la leadership dell’Emilia-Romagna, seguita dal Veneto, dalla Sardegna e dalla Puglia. In Sardegna le attività legate alla molluschicoltura sono presenti sin dal primo dopoguerra, quando vennero impiantati i primi allevamenti. Attualmente il comparto della molluschicoltura sarda appare consolidato: nel 2008, l’83% delle specie allevate in acquacoltura era rappresentato da molluschi, per un fatturato pari a Euro19.723.715,00 (Sardegna Agricoltura/Laore, 2009). La mitilicoltura, in particolare, occupa una posizione di rilievo: nel 2008 sono state prodotte in Sardegna circa 11.000 t di mitili, con un incremento del 60% rispetto al 1992 (Sardegna Agricoltura/Laore, 2009). Gli allevamenti di mitili sono dislocati principalmente nelle province di Oristano, Cagliari, Ogliastra ed Olbia-Tempio. Tuttavia, la maggior parte degli allevamenti è situata nel Golfo di Olbia, dove nel 1919, ad opera di alcuni imprenditori di La Spezia, venne installato il primo impianto di mitilicoltura in Sardegna (Dessì, 2009). Attualmente nel Golfo di Olbia operano diverse imprese di mitilicoltori, che hanno dato vita ad un’Organizzazione di Produttori (OP) ed hanno promosso interessanti iniziative finalizzate alla tutela della qualità e salubrità dei mitili ed alla difesa dell’ambiente marino. Sono stati, poi, realizzati progetti di valorizzazione del prodotto locale, tra cui la richiesta del marchio di origine Igp – Indicazione Geografica Protetta).

La mitilicoltura regionale concentra gran parte della produzione e della commercializzazione all’inizio del periodo estivo. Negli altri periodi dell’anno la produzione locale non è sufficiente a coprire la domanda di prodotto. In particolare, nel periodo autunno-inverno è frequente il riscontro sul mercato regionale di prodotti provenienti da allevamenti del Nord Italia o importati dalla Spagna, mentre nel periodo primavera-estate è presente in genere prodotto importato dalla Grecia. Questa particolare caratteristica del mercato determina, anche a fronte di una domanda sostenuta durante tutto l’anno, una disponibilità di prodotto costante e quindi oscillazioni dei prezzi non rilevanti (Ismea, 2007). La maggior parte degli allevamenti ricade in zone di produzione di classe B (classificazione secondo la normativa europea, Reg. CE 854/2004). I molluschi bivalvi vivi raccolti da queste zone possono essere immessi sul mercato ai fini del consumo umano soltanto dopo aver subito un trattamento di depurazione presso stabilimenti riconosciuti (Centro Depurazione Mitili) o presso una zona di stabulazione. L’efficacia dei trattamenti di stabulazione o di depurazione viene valutata in relazione alla rispondenza ai criteri microbiologici di sicurezza alimentare previsti dal Reg. CE 2073/2005 (assenza di Salmonella spp. e presenza di un numero di E. coli <230 MPN, rispettivamente in 25 e 100 g di polpa e liquido intervalvare) e a quelli relativi alle biotossine marine previsti dal Reg. CE 853/2004 (PSP: 800 µg/kg; ASP: 20 mg/kg di acido domoico; Acido okadaico, Dinophysitossine e Pectenotossine: 160 µg/kg; Yessotossine: 1 mg di equivalente yessotossine/kg; Azasparacidi: 160 µg di equivalente azaspiracido/kg). I mitili, in quanto organismi filtratori, sono capaci di concentrare nel proprio organismo sostanze particolate e contaminanti associati a tali particelle, come microrganismi, virus, tossine algali e sostanze chimiche (Huss, 2000). Ogni organismo è in grado di filtrare 1,5 litri d’acqua/h, ad una temperatura di 14-15°C, per un totale, nell’arco di una giornata, di 36 litri di acqua (Battisti et al., 2006). Tale quantitativo può arrivare anche a 4-5 litri/h, se la temperatura è di 20°C (Corrain et al., 2007).

Circa il 90% delle particelle sospese nell’acqua filtrata viene trattenuto e digerito: le dimensioni di tali particelle possono variare da 1-5 µm a 400-500 µm Corrain et al., 2007). Per tale ragione i mitili possono essere causa di tossinfezione alimentare, inserendosi nel circolo uomoambiente-uomo, in cui rivestono il ruolo di anello di collegamento (Parisi, 2004; Battisti et al., 2006). Secondo i dati del Centre of Disease Control (USA), le tossinfezioni connesse al consumo di molluschi sono causate principalmente (20%) da virus enterici (Corrain et al., 2007), in prevalenza virus dell’epatite A (HAV) e norovirus (NV), e da patogeni abitualmente presenti nell’ambiente marino, come Vibrio spp. I batteri di origine fecale (Salmonella spp. ed E. coli), contaminanti accidentali delle acque, incidono invece solo per il 4% del totale (Serracca et al., 2007). In Italia al consumo di molluschi sono attribuiti il 7% degli episodi tossinfettivi notificati (Parisi, 2004); tuttavia, si stima che il numero dei casi reali sia circa 20 volte superiore (Suffredini e Croci, 2001), in particolare nelle regioni meridionali, dove persiste la tradizione del consumo dei molluschi crudi (Normanno et al., 2006). Come precedentemente accennato, nel Reg. CE 2073/2005, tra i criteri di sicurezza per i molluschi bivalvi, sono considerati Salmonella spp. ed E. coli, la cui presenza viene tuttavia ritenuta scarsamente predittiva nei confronti di vibrioni potenzialmente patogeni (Kong et al., 2002), salvo che per V. cholerae O1 (Cavallo et al., 2002), e dei virus enterici (Franco et al. 1990). Non è invece prevista la determinazione dei vibrioni patogeni, per i quali sono necessari ulteriori approfondimenti ai fini della definizione di criteri specifici. Essi possono, tuttavia, essere frequentemente trattenuti dai molluschi; inoltre, va considerato che le comuni tecnologie utilizzate per la depurazione dei molluschi bivalvi risultano efficaci in poche ore nella eliminazione di batteri di origine fecale, come E. coli (Serratore et al., 2007), mentre hanno uno scarso effetto nella riduzione di Vibrio spp. e dei virus enterici. I dati bibliografici relativi alla prevalenza dei microrganismi appartenenti al genere Vibrio spp. nei molluschi sono discordanti e molto variabili. Tale variabilità è principalmente da attribuire all’assenza di metodiche standardizzate, per cui vengono riportati protocolli di indagine differenti, specie per le temperature di incubazione adottate (da 20-25°C a 37°C), che producono dati non confrontabili. Studi recenti eseguiti in Italia hanno evidenziato prevalenze di Vibrio spp. comprese tra il 45% (Parisi et al., 2004) ed il 93% (Serracca et al., 2007). Il presente lavoro è stato programmato allo scopo di valutare l’efficacia dei sistemi di depurazione, attraverso la valutazione dell’impatto del trattamento sia sui criteri di sicurezza previsti dalla normativa (Salmonella spp., E. coli) che sugli altri agenti patogeni (Vibrio spp.) in mitili (Mytilus galloprovincialis) allevati nel Golfo di Olbia, area tradizionalmente vocata a tali produzioni.

Materiali e metodi

L’indagine è stata condotta su campioni di mitili prelevati presso un Centro di Depurazione (CDM) e Spedizione (CSM), annesso all’allevamento, situato in una zona di produzione di classe B. L’impianto di depurazione, in cui venivano utilizzati bins isotermici, funzionava sia a circuito aperto che chiuso e prevedeva l’impiego di 2 sistemi di filtrazione (meccanico e biologico), dell’ozonizzazione e delle lampade a raggi UV (l 254 nm). Sono stati inclusi nell’indagine 10 lotti di mitili (L1 —> L10). Il campionamento si è svolto in 2 fasi, condotte in periodi differenti per valutare l’effetto della stagionalità. La fase 1 (L1 —> L5) si è svolta nel periodo compreso tra gennaio e febbraio 2008, mentre la fase 2 (L6 —> L10) tra giugno e luglio 2008. Nel corso di ciascun campionamento sono stati preventivamente monitorati la temperatura, la salinità e il pH dell’acqua utilizzata per la depurazione.

I campioni di mitili (circa 2 kg) sono stati prelevati nelle seguenti fasi: all’inizio del processo di depurazione (T0); in una fase intermedia, dopo circa 4 ore (T4); al termine, dopo circa 8 ore, prima del confezionamento (T8). La preparazione del campione da sottoporre ad analisi è stata effettuata secondo quanto indicato nelle norme di riferimento (EN/ISO 6887-32004; EN/ISO 7218:2007). Su ciascun campione sono stati determinati i seguenti parametri: pH (metodo potenziometrico, pH-metro GLP22Crison, Italia); E. coli (ISO/TS 16649-3:2005); Salmonella spp. (EN/ISO 6579: 2002); Vibrio spp. Da ciascun campione veniva prelevata una aliquota di polpa e liquido intervalvare di 25 g di peso, che veniva diluita, in rapporto 1/10, in 225 ml di Alkaline peptone water, addizionato dell’1% di NaCl (Lab M. limited, UK). Tutti i campioni venivano omogeneizzati per un periodo variabile da 1 a 3 minuti in Stomacher-Lab-Blender 400 (Sacco, Italia) e inoculati in piastre di Thiosulphate Citrate Bile Salt Sucrose Agar (TCBS Cholera medium, Lab M limited, UK), additivato di NaCl fino ad una concentrazione finale del 3% (iniziale 1%) e portato a pH 8,4. Le piastre venivano poste ad incubare a 20°C per 72 h (Serratore et al., 2007). I risultati sono stati sottoposti ad analisi della varianza (ANOVA), mediante procedura GLM. Le differenze tra le medie sono state valutate mediante LSD test Statgraphics Plus 5.1, (Statpoint Technologies, Inc., Warrenton, Virginia, USA).

Risultati

I risultati sono riassunti nella Tabella 1 e nei Grafici 1 e 2.

a) Parametri ambientali. Il valore medio della temperatura dell’acqua è risultato pari a +16°C, mentre i valori medi (media±d.s.) del pH e della salinità erano pari a 8,44±0,10 e 30,0±1,0‰. Non sono state riscontrate variazioni dei parametri chimico-fisici dell’acqua in relazione al periodo del prelievo (p>.05), nonostante durante il periodo estivo (secondo ciclo di campionamenti) venisse attivato il sistema a circuito chiuso, che prevede lo stoccaggio e la refrigerazione dell’acqua marina utilizzata per la depurazione.

Complessivamente sono stati analizzati n. 30 campioni, pari a un quantitativo di mitili di ~60 kg.

b) pH. I valori medi di pH dei mitili sono risultati omogenei in relazione al lotto (p<.05). Non sono state invece riscontrate differenze significative in relazione alla fase del processo (p>.05). I valori medi, risultati irregolarmente inferiori nei prodotti analizzati al termine del processo, sono stati: 6,34±0,01 (T0); 6,25±0,03 (T4); 6,28±0,02 (T8).

c) E. coli. La presenza (Tabella 1) è risultata variabile (p>.05) in relazione al lotto di produzione e, in tutti i campioni, contenuta entro i criteri previsti dal Reg. (CE) 2073/2005 per i prodotti immessi sul mercato, con una tendenza ad una progressiva e significativa (p<.01) riduzione nel corso del processo. La prevalenza era pari al 90% nei campioni prelevati al T0, al 50% al T4 e al 30 % al T8. I valori (media±d.s. MPN/100 g) relativi ai 10 lotti sono risultati pari a 89,2±82,01 al T0, 26,04±20,08 al T4 e 17,9±1,44 al T8. Non sono state riscontrate variazioni statisticamente significative in relazione alla stagione (p>.05), ciononostante la prevalenza è risultata superiore nei campioni prelevati nel periodo invernale rispetto a quello estivo al T0 (rispettivamente 100% e 80%) e T4 (rispettivamente 60% e 40%). Viceversa, nei campioni prelevati al T8 la prevalenza nel primo periodo era pari al 20% mentre nel secondo era del 40%. Anche i livelli di contaminazione sono risultati disomogenei (p>.05) in relazione alla stagione. Il valore più elevato, pari a 230 MPN/100 g, è stato riscontrato in tre campioni appartenenti ai lotti L3 ed L5 prelevati al T0. I lotti analizzati durante il periodo estivo (L6-L10) presentavano, invece, livelli di contaminazione inferiori e solo in un campione del lotto L6, prelevato al T0, sono stati riscontrati livelli superiori a 100 MPN/100 g.

d) Salmonella spp. Non è stata rilevata in nessuno dei campioni analizzati.

e) Vibrio spp. La prevalenza (Tabella 1) è risultata elevata (dal 40 al 100%), indipendentemente dal lotto e dalla fase di campionamento. Nel corso del trattamento di depurazione è stata evidenziata una limitata e disomogenea riduzione della prevalenza e del livello di contaminazione di Vibrio spp., che è risultato contenuto entro 1 unità logaritmica. Non sono state riscontrate differenze nei livelli di contaminazione in relazione alla stagione del prelievo (p>.05): il livello medio di contaminazione (media±d.s. Log10 ufc/g) dei campioni prelevati al momento T0 è risultato pari a 8,13±0,65 (lotti 1-5) nel periodo invernale e a 7,85±0,60 (lotti 6-10) in quello estivo. L’efficacia della depurazione su questo parametro è risultata variabile: i valori medi riscontrati al T8 sono risultati pari a 7,69±0,62 (lotti 1-5) nel periodo invernale e a 8,01±0,42 (lotti 6-10) in quello estivo.

Considerazioni e conclusioni

La presente indagine costituisce un contributo pratico all’acquisizione di dati di campo a supporto dei criteri per la classificazione degli stabilimenti di depurazione dei mitili in classi di rischio e fornisce inoltre utili indicazioni agli OSA relativamente al rispetto dei criteri di sicurezza dei prodotti. I risultati hanno evidenziato che il sistema di depurazione utilizzato si dimostra efficace nei confronti dei criteri microbiologici previsti dalla normativa, la cui presenza è risultata non rilevabile (Salmonella spp.) o contenuta (E. coli). Le analisi effettuate nel corso del processo hanno confermato (Croci et al., 2002) la capacità di autodepurazione dei mitili nei confronti di E. coli ed evidenziato che, in presenza di una contaminazione iniziale contenuta, i produttori possono ridurre efficacemente i tempi di depurazione (~8 ore). La capacità di rilasciare Vibrio spp. è risultata invece notevolmente inferiore. Ciò conferma quanto descritto da altri autori, secondo i quali i mitili trattengono più a lungo tutte le specie microbiche adattate all’habitat acquatico (Jackson et al., 1999). Tale riscontro pone serie problematiche igienico-sanitarie, in quanto, in presenza di inadeguate misure di condizionamento dei mitili nelle fasi successive alla depurazione, si può assistere ad un incremento del rischio connesso alla presenza di vibrioni potenzialmente patogeni, che possono raggiungere livelli critici per la salute del consumatore (Croci et al., 2002; Battisti et al., 2006). Pertanto, risulta necessario, allo scopo di tutelare la salute del consumatore, ma anche per salvaguardare l’interesse dei mitilicoltori, approfondire lo studio del processo di depurazione in condizioni controllate, mettendo in evidenza i limiti delle tecnologie impiegate, affinché ne venga migliorata l’efficacia (Serratore et al., 2007).

La corretta conduzione di un CDM dovrebbe prevedere adeguati programmi di manutenzione, basati su procedure scritte e schede operative indispensabili per assicurare l’implementazione di un efficace sistema di controllo. La verifica delle prestazioni dell’impianto deve essere accompagnata dalla conoscenza delle caratteristiche microbiologiche delle acque di provenienza del prodotto. Inoltre, durante il processo di depurazione, devono essere evitate eventuali contaminazioni crociate, attraverso il controllo di tutti materiali e le sostanze che vengono a contatto con i prodotti, con particolare riguardo alla qualità dell’acqua utilizzata, specie in caso di ricircolo. Infine, ulteriori prospettive scientifiche sono rappresentate dalla caratterizzazione dei Vibrio spp. isolati, ai fini della determinazione della specie e dei fattori di patogenicità.

D. Meloni
A. Mureddu
G. Sferlazzo
R. Mazzette
Dip. di Biologia Animale - Sez. Ispezione Alimenti di O.A. - Università degli Studi di Sassari

M. Pisanu
S. Virgilio S.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna - Sassari

S. Serra
A. Tempesta
A. Piras
ASL n. 2, Olbia

Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il “Consorzio Maricolotori di Olbia” per l’indispensabile supporto e la partecipazione alla realizzazione della presente ricerca.

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