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Il Pesce nr. 5, 2003

Rubrica: La pagina scientifica
Articolo di Stella S. , Cozzi M. , Magnani C. , Cantoni C. ,
(Articolo di pagina 117)

Flora batterica e deterioramento in filetti di trote d’allevamento

 


Carlo Cantoni

 

Batteriologia delle acque e del pesce d’acqua dolce: generalità

Il deterioramento di prodotti ittici quali pesce, molluschi e crostacei è causato da modificazioni che vengono indotte da reazioni di ossidazione, da reazioni dovute ad enzimi specifici del pesce e dalle attività metaboliche dei microrganismi.

Le modificazioni post mortem che conducono al deterioramento dipendono da diversi fattori e, in modo particolare, dalla composizione chimica del pesce, dalla sua flora microbica e dalle manipolazioni, lavorazioni e conservazioni che esso subisce. La composizione chimica e la flora microbica del pesce variano considerevolmente tra le diverse specie, ma anche a seconda delle differenti zone di pesca e delle stagioni.

Dopo la cattura del pesce, in seguito ai vari processi di trasformazione, da ogni specie possono derivare una serie di prodotti diversi, con differenti caratteristiche di conservazione e deterioramento.

Nel pesce vivo e sano la carne è sterile; i microrganismi sono infatti presenti solo sulla superficie esterna dell’animale e nel tratto intestinale. Trattandosi di animali a sangue freddo, la loro microflora è notevolmente suscettibile di modificazioni, che riflettono generalmente cambiamenti di ambiente o di dieta.

Nell’immediato post mortem inizia, nella carne di pesce, una serie di reazioni enzimatiche che conducono al deterioramento. In determinati stadi di questo processo, l’azione dei batteri diviene altamente significativa. Dalla letteratura (Shewan, 1977; Linston, 1980; Hobbs & Hodgkiss, 1982) risulta chiaro che la maggior parte delle modificazioni che avvengono durante la conservazione del pesce deriva dall’attività batterica. Si ha quindi la comparsa di odori ed aromi indesiderabili, che sono dovuti per lo più al metabolismo batterico di proteine, aminoacidi, basi azotate ecc…

Con il procedere del deterioramento, si assiste ad una graduale invasione della carne di pesce da parte di batteri provenienti da superfici più esterne. La distruzione della struttura muscolare avviene solo dopo che il deterioramento è andato ben oltre il punto in cui il prodotto è considerato di scarto.

La flora microbica del pesce pescato di fresco

Il numero e la tipologia di batteri isolati dal pesce dipendono dal terreno e dalle condizioni di incubazione impiegate che, nella maggior parte degli studi, sono state selezionate appositamente per isolare la flora microbica attiva nelle particolari condizioni di conservazione del pesce da studiare.

Per quanto riguarda le conte dei microrganismi vitali effettuate su pesci conservati in mezzi costituiti da acqua di mare o da acqua dolce, è risultato che queste sono raramente differenti, poiché anche nell’acqua dolce sono presenti dei sali (solitamente circa lo 0,5%).

La temperatura di incubazione non ha effetti evidenti tra 0 e 20°C, ma a 37°C le conte vitali divengono solo 1/10 rispetto a quelle ottenute a temperature più basse. In letteratura ci sono esempi che mostrano l’influenza di variazioni stagionali sul numero di batteri presenti sul pesce.

Pur essendoci considerevoli differenze nella composizione della flora microbica riportata dai diversi Autori, i generi predominanti sono relativamente pochi.

Shewan (1977) ha evidenziato che in 9 campioni su 17 la microflora era rappresentata, per più dell’80%, da Gram negativi, in 2 casi i Gram negativi rappresentavano il 65-70% ed in 1 campione essi rappresentavano circa il 40%. Una situazione del genere è tipica dei pesci pescati in acque fredde; infatti nei pesci pescati in acque calde o tropicali si riscontra una predominanza di batteri Gram positivi.

Nei primi studi esistevano difficoltà nella caratterizzazione di molti batteri, non solo per la mancanza di criteri oggettivi per la determinazione e di adatti test di laboratorio, ma anche per l’assenza, in quell’epoca, di una precisa nomenclatura e tassonomia degli organismi (Ingram e Shewan, 1960); i vari ceppi batterici venivano, infatti, immessi in gruppi o generi relativamente ampi (Shewan et al., 1960).

Da allora metodi più moderni, test di identificazione più appropriati e cambiamenti nella nomenclatura e nella tassonomia hanno provocato modificazioni nella classificazione di molti dei batteri considerati (Gibson & coll., 1977). Si è così scoperto che organismi precedentemente assegnati al genere Achromobacter erano in realtà una collezione eterogenea.

Il genere Achromobacter, come definito nella sesta edizione del Bergey’s Manual (Breed & coll., 1984) includeva:

1) ceppi non mobili ora chiamati Moraxella (Baumann & coll., 1968a) o Acinetobacter (Baumann & coll., 1968b) a seconda della loro attività ossidasica;

2) ceppi mobili peritrichi assegnanti ora al genere Alcaligenes (Hendrie & coll., 1974; Buchanan & Gibbsons, 1974);

3) ceppi mobili non fluorescenti con flagelli polari ora identificati come Pseudomonas o Alteromonas.

Tutto questo è da tenere presente nel caso si faccia riferimento a studi di quell’epoca. La flora batterica che si ritrova sul pesce fresco consiste in una serie di microrganismi appartenenti sia ai Gram negativi (Pseudomonas, Alteromonas, Moraxella, Acinetobacter, Vibrio, Flavobacterium e Cytophaga) che ai Gram positivi, come i corineformi e i micrococchi.

La classificazione dei bastoncini aerobi Gram negativi sta diventando sempre più complessa, vista la nascita di molti nuovi generi e la descrizione di numerose specie nuove. Le specie del genere Pseudomonas costituiscono un parte sostanziosa della microflora dei saprofiti indigeni del suolo, delle acque dolci, delle acque sotterranee, delle zone marine e di molti altri habitat naturali, specialmente vegetali.

Nel corso dell’ultimo decennio c’è stata una considerevole revisione delle relazioni filogenetiche di questi organismi, dovuta alla descrizione di nuovi gruppi, inclusi i Proteobatteri. Gli organismi isolati più di frequente dalle acque appartengono alle sottoclassi a, b, e, g, dei Proteobatteri e specialmente al genere Pseudomonas che appartiene al gruppo rRNA 1 (Kersters & coll., 1997). Tutte le specie sono aerobie, con un metabolismo strettamente respiratorio. I microrganismi più frequentemente isolati dalle acque sono mostrati nella Tabella allegata.

La percentuale di ceppi non identificati, in alcuni studi, raggiunge l’80%, ma ciò non deve stupire, vista la diversità fenotipica e genotipica dei batteri delle acque sotterranee e delle specie non classificate provenienti dal sottosuolo. Inoltre alcune specie comuni sono abbastanza eterogenee; è il caso ad esempio di P. fluorescens, che può essere suddiviso con vari criteri in sottospecie e varietà. Anche Pseudomonas aeruginosa è frequentemente isolato dalle acque di superficie.

E. coli è un indicatore specifico di contaminazione fecale e il suo ritrovamento può essere un segnale della possibile presenza di parassiti pericolosi per la salute umana. I coliformi, presenti in abbondanza nel suolo e nella vegetazione terrestre, possono facilmente contaminare le acque, anche se non sono un indice di rischio imminente per la salute (Bischofberger & coll., 1990).

La frequenza di ritrovamento di questi batteri varia considerevolmente appunto perché risulta assai variabile la microflora ambientale, che influenza quella del pesce.

Per quanto riguarda i pesci d’acqua dolce, i dati sono piuttosto carenti, ma le informazioni disponibili (Herborg & Villadsen, 1975; Cantoni & coll., 1976; Wyatt, 1978) mostrano che alla microflora cutanea di questi pesci appartengono gli stessi pochi generi che si riscontrano nei pesci marini, con le stesse variazioni dipendenti dall’ambiente.

Modificazioni nel pesce conservato al freddo

La maggior parte degli studi effettuati sul deterioramento del pesce sono stati condotti utilizzando pesce conservato a 0°C in ghiaccio fondente. Le analisi batteriologiche sono state condotte, nella maggior parte dei casi, con temperature di incubazione intorno ai 20°C in quanto molti dei batteri che crescono a 0°C possiedono la temperatura ottimale di sviluppo attorno ai 18-20°C. Questo consente un notevole guadagno nel tempo di incubazione, senza perdita di dati significativi.

È da ricordare, però, che esistono elementi della microflora che crescono rapidamente a 18-20°C, ma non crescono affatto sotto i 5°C, in particolare i batteri Gram positivi (corineformi, micrococchi).

Si è così stabilito che il numero totale di batteri aumenta sistematicamente durante la conservazione in ghiaccio e che i generi Gram negativi come Pseudomonas, Alteromonas, Moraxella e Acinetobacter, diventano progressivamente predominanti, tanto che, alla fine della vita commerciale del pesce essi rappresentano la maggioranza della carica batterica totale. Questo fatto ha reso evidente l’importanza di questi generi nel processo di deterioramento; da queste considerazioni potrebbe sembrare che una conta vitale totale a 20°C possa essere usata come una misura del deterioramento; esistono, comunque, alcune grosse limitazioni.

Innanzitutto, come già detto, la conta iniziale effettuata subito dopo la pesca può essere assai variabile. Secondariamente, si è visto che spesso il numero dei germi ritrovati non concorda con le caratteristiche organolettiche del pesce. È stato possibile notare, in diverse occasioni, come non tutti i batteri presenti sul pesce producano deterioramento dell’odore e dell’aroma.

Per esempio Shewan e Murray (1979) hanno descritto diversi esperimenti nei quali muscoli sterili di pesce inoculati con colture pure di ceppi di Moraxella e Acinetobacter non hanno prodotto il tipico deterioramento dell’odore, mentre il contrario avveniva utilizzando inoculi di Pseudomonas e Alteromonas.

Al fine di definire un indice di deterioramento, per molti anni è stato valutato anche il livello di accumulo di vari composti chimici nelle carni di pesce (Fields & coll., 1968; Connell & Shewan, 1980).

I caratteristici odori ed aromi del pesce fresco, così come quelli tipici del deterioramento, sono principalmente determinati dalle sostanze azotate. È da ricordare che molti composti che si ritrovano nel pesce sono prodotti dalla crescita batterica: i più importanti sono i composti azotati quali la trimetilamina (dall’ossido di trimetilamina), varie amine ed ammoniaca (dalla degradazione degli aminoacidi) e quelli solforati come l’idrogeno solforato, il dimetilsolfuro ed il metil mercaptano (da aminoacidi contenenti zolfo). Si è inoltre osservata la produzione di acidi grassi (da zuccheri come glucosio e ribosio), composti carbonilici (dai lipidi), indolo, tiroxina, putrescina e cadaverina (dalle proteine) (Connell & Shewan, 1980).

Levin (1968) ha concluso che Alteromonas putrefaciens (Shewanella putrefaciens) è un organismo molto importante per il deterioramento del pesce.

Herbert e Shewan (1976) hanno, quindi, dimostrato che tutti i 13 ceppi di Pseudomonas e Alteromonas da loro testati erano attivi nella produzione di H2S e metilmercaptano: 6 di questi producevano anche diletilsolfuro. È stato perciò stabilito che i composti sulfurei volatili non si liberano da reazioni autocatalitiche.

Utilizzando omogenati di muscolo sterile di pesce, Miller & coll. (1972; 1973 a, b, c) hanno evidenziato la presenza di un’ampia serie di prodotti metabolici derivanti da colture di diversi batteri deterioranti. Da questi studi si è anche riusciti a correlare alcuni di questi composti con specifiche alterazioni dell’odore. Tali batteri non fermentativi sono in grado di crescere rapidamente nelle condizioni microaerofile od anaerobiche esistenti nei tessuti del pesce in via di deterioramento. I processi di deterioramento descritti possono venir notevolmente modificati dalla manipolazione e dai processi di trasformazione, il cui scopo è spesso proprio quello di prevenire o rallentare il deterioramento. La sterilizzazione con calore, il congelamento e la surgelazione eliminano virtualmente l’attività microbica, benché l’attività enzimatica continui anche con le basse temperature. Il congelamento rapido, oltre a conservare intatto il pesce, permette però anche la sopravvivenza dei microrganismi, che possono così continuare a riprodursi e a deteriorare il prodotto dopo lo scongelamento (Hobbs & Hodgkiss, 1982).

Tramite altri processi si può prolungare la "vita di immagazzinamento" del pesce, ma non si previene totalmente la crescita batterica. Esempi sono la cottura e la pastorizzazione con calore o irradiazione, la riduzione dell’attività dell’acqua mediante salagione o essiccamento o la diminuzione del pH mediante fermentazione; tutti questi processi sono relativamente più efficaci verso i batteri Gram negativi.

La manipolazione e la trasformazione, specialmente se effettuate in condizioni non igieniche, possono naturalmente introdurre batteri di origine ambientale. Un esempio è rappresentato dall’introduzione di batteri strettamente alofili durante la salagione del pesce.

Concludendo, risulta evidente il fatto che, in seguito alla conservazione a basse temperature di pesce o crostacei, si sviluppa una flora batterica prevalentemente Gram negativa. Numericamente i generi più importanti sono Pseudomonas, Alteromonas, Acinetobacter e Moraxella. Tra questi, Pseudomonas ed Alteromonas sono segnalati come i principali responsabili del deterioramento di questi prodotti nel corso della conservazione, grazie alla produzione di diversi composti alteranti. Si è visto inoltre che l’utilizzo della carica batterica totale come indice di deterioramento o di freschezza del pesce ha avuto un successo decisamente limitato.

La maggior parte delle ricerche nel campo della conservazione del pesce è stata finora condotta sul pesce conservato a temperature intorno a 0°C; tuttavia, nella pratica commerciale, le fluttuazioni di temperatura sono abbastanza comuni e questo può attivare altre componenti della flora batterica, esitando in una differente sequenza di modificazioni sensoriali.

Carlo Cantoni

Carlo Romano Magnani

Massimo Cozzi

Simone Stella

Dipartimento di Scienze

e Tecnologie Veterinarie

per la Sicurezza Alimentare

via Celoria 10 — 20133 Milano

E-mail: carlo.cantoni@unimi.it

La bibliografia utilizzata è disponibile presso gli autori.

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