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Il Pesce nr. 4, 2000

Rubrica: La pagina scientifica
Articolo di Missiroli M. L.
(Articolo di pagina 67)

Metabolismo anaerobico in bivalvi marini

Tra gli Invertebrati marini, i Molluschi bivalvi sono considerati organismi euriossici cioè caratterizzati da lunghi tempi di sopravvivenza in condizioni di ipossia o di anossia, grazie alla facoltà di possedere un efficiente metabolismo anaerobico. Molti Bivalvi, in particolari condizioni ambientali, possono sopravvivere anche alcuni mesi, come avviene per Mytilus edulis e Cyprina islandica, due specie di mitili tipici del Mare del Nord, i quali possono essere considerati anaerobi facoltativi (Figura 1).

I Bivalvi marini si trovano spesso ad affrontare una situazione di anaerobiosi ambientale, cioè una diminuita disponibilità fino ad una mancanza totale di ossigeno nell’ambiente, proprio per le caratteristiche dell’habitat in cui vivono, infatti, l’ambiente acquatico marino contiene una quantità di ossigeno disciolto minore rispetto all’ambiente di acqua dolce o terrestre: ad una temperatura di 20 °C nell’aria si hanno circa 210 mg/litro di ossigeno contro i 7 mg/litro in acqua salata (R.J. Roberts, 1989); inoltre la solubilità dell’ossigeno nell’acqua è inversamente proporzionale alla temperatura, alla salinità e dipende anche dalla pressione atmosferica, dalla quantità di sostanza organica presente e da fenomeni di eutrofizzazione che privano ulteriormente l’ambiente di ossigeno. Infine la maggior parte dei Molluschi bivalvi sono organismi sessili che vivono in zone intertidali e, quindi, si trovano periodicamente esposti all’aria durante la bassa marea.

Per superare questa situazione di anaerobiosi ambientale, in quanto questi organismi non sono in grado di respirare l’ossigeno atmosferico, molti Bivalvi hanno adottato la strategia di trattenere una certa quantità di acqua all’interno delle valve per sottrarre, attraverso la respirazione branchiale, quel po’ di ossigeno presente; quando anche questo viene a mancare, aprono le valve in modo da favorire uno scambio aria-acqua, la quale in questo modo, può arricchirsi nuovamente di ossigeno. Un’altra strategia difensiva è quella di avere adottato uno stile di vita gregario in modo da essere più protetti e riparati da danni arrecati da agenti atmosferici come esposizioni prolungate al sole.

Sicuramente la elevata sopravvivenza in condizioni di anaerobiosi ambientale si basa anche su adattamenti di tipo biochimico ed, in particolare, sulla notevole adattabilità metabolica dovuta ad una ampia varietà e flessibilità della via anaerobica del catabolismo glucidico. La glicolisi anaerobica utilizzata dai Bivalvi presenta numerose differenze rispetto a quella dei Vertebrati: innanzitutto la utilizzazione di vie metaboliche alternative che portano alla formazione di diversi prodotti finali (lattato, opine, alanina, succinato e propionato) e garantiscono una maggiore resa di ATP per mole di substrato, inoltre il ciclo di Krebs rimane funzionante anche in condizioni di anaerobiosi. La utilizzazione di substrati diversi come aspartato o malato (negli Invertebrati di acqua dolce), garantiscono un risparmio di glicogeno; si verifica anche una maggiore tolleranza alla acidosi ed un rapido recupero dopo la anaerobiosi. L’effetto Pasteur è assente (cioè l’aumento esponenziale della intensità del catabolismo glucidico causato dall’aumento della domanda energetica) e, quindi nei Bivalvi si verifica un rallentamento di tutto il metabolismo anaerobico in concomitanza con una diminuzione della richiesta energetica (De Zwaan, 1983). Quest’ulteriore strategia di riduzione dell’intensità metabolica, che, a seconda delle specie, può variare tra il 5 ed il 20% del valore aerobico, è dovuta all’azione di meccanismi molecolari che controllano l’attività dei tre enzimi chiave che regolano l’intensità del catabolismo glucidico: glicogeno fosforilasi, fosfofruttocinasi e piruvato cinasi.

Sulla base di questi adattamenti riscontrati nei Bivalvi in condizioni anossiche, oggetto di questo studio sono state quattro specie di Molluschi bivalvi presenti nelle aree costiere Adriatiche: Chamelea gallina, Tapes philippinarum e Mytilus galloprovincialis, di notevole importanza dal punto di vista economico, numerosi sono infatti gli allevamenti di mitili e di vongole situati in tratti di mare in cui spesso si verificano fenomeni di eutrofizzazione, come nel Nord Adriatico, che portano a condizioni di ipossia o di anossia; e Scapharca inaequivalvis, di scarso valore dal punto di vista commerciale, ma interessante per gli elevati tempi di sopravvivenza che ne hanno favorito la diffusione in Adriatico, dopo la sua introduzione dall’Oceano Indo-Pacifico.

Partendo da questi presupposti e dal fatto che in precedenti ricerche erano stati riscontrati tempi di sopravvivenza variabili da pochi giorni per Chamelea gallina fino anche ad un mese per Scapharca inaequivalvis, a seconda delle condizioni ambientali, gli scopi del presente lavoro possono essere riassunti in tre punti:

1) Misurare sia in condizioni aerobiche che anaerobiche l’attività enzimatica della piruvato cinasi (PK), un enzima chiave nel regolare l’intensità del catabolismo glucidico, in esemplari di Chamelea gallina, Tapes philippinarum, Mytilus galloprovincialis e Scapharca inaequivalvis sottoposti ad incubazione anossica sperimentale, al fine di confrontare i parametri cinetici dell’enzima stesso come la Vmax e la Km: per Vmax si intende la velocità massima che può raggiungere la reazione enzimatica in condizioni sperimentali; mentre la Km è un parametro che è indice dell’affinità dell’enzima per il substrato: se il valore è basso l’enzima è molto affine al substrato; se il valore è alto l’enzima è poco affine al substrato;

2) Si è cercato di correlare l’attività enzimatica ai tempi di sopravvivenza in anossia delle quattro specie considerate;

3) Infine si è cercato di approfondire i meccanismi di regolazione enzimatica nelle specie caratterizzate da maggiore sopravvivenza.

 

Parte sperimentale Materiali e metodi

Gli esemplari di Chamelea gallina, Tapes philippinarum, Mytilus galloprovincialis e Scapharca inaequivalvis sono stati raccolti nel tratto di mare Adriatico prospiciente Cesenatico e tenuti per alcune settimane in vasche contenenti acqua di mare circolante, prima degli esperimenti. In seguito un pool di individui per ognuna delle quattro specie sono stati incubati rispettivamente in beute contenenti 2,5 litri di acqua di mare deossigenata sotto continua corrente di azoto ad una temperatura di 18 °C. La durata dell’esposizione all’anaerobiosi è stata variabile fino ad un massimo di 96 ore, con prelievi di animali ad intervalli prefissati per la dissezione; gli animali utilizzati per il controllo aerobico sono stati prelevati direttamente dalle vasche di stabulazione.

L’attività enzimatica della piruvato cinasi (PK) è stata misurata nel tessuto muscolare dove il catabolismo glucidico è particolarmente intenso in quanto fonte di energia immediata ed, in particolare, è stato scelto il muscolo adduttore posteriore (M.A.P.) in quanto ugualmente sviluppato in ognuna delle quattro specie indagate. La cinetica enzimatica della piruvato cinasi è stata determinata tramite spettrofotometria UV-VIS secondo quanto riportato da Isani (1987) e da Brooks et al. (1991). Le concentrazioni del substrato il fosfoenolpiruvato (PEP) sono state variabili in funzione del tipo di studio cinetico condotto. Quando sono state determinate le attività della PK nelle quattro specie esaminate sottoposte ad anaerobiosi sperimentale a breve termine, sono state usate concentrazioni di PEP variabili tra 0,05 e 6 mM; mentre quando sono state determinate le attività della PK in Scapharca inaequivalvis, per il calcolo del valore della "PK ratio", un parametro che consente di osservare in modo più immediato la variazione dell’attività enzimatica in relazione all’anossia, sono state usate due concentrazioni di PEP: una saturante (2 mM) e una subsaturante (0,05 mM); per ottenere l’attività massima di controllo è stato aggiunto l’attivatore fruttosio-1,6-difosfato (0,1 mM). I parametri cinetici della PK (Km e Vmax) sono stati calcolati dal grafico di Lineweaver-Burk o dal grafico di Hill tramite un programma computerizzato per il calcolo delle rette di regressione.

 

Risultati

Nella Figura 2 sono riportati i risultati relativi alle prove dell’attività enzimatica della piruvato cinasi (PK) nel muscolo adduttore posteriore (M.A.P.) di Chamelea gallina, Tapes philippinarum, Mytilus galloprovincialis e Scapharca inaequivalvis in funzione delle variazioni di concentrazione del substrato il fosfoenolpiruvato (PEP). Le variazioni dell’attività enzimatica sono state registrate per Chamelea gallina e Scapharca inaequivalvis, dopo 12 ore di incubazione anaerobica; mentre per Tapes philippinarum dopo 24 ore e per Mytilus galloprovincialis dopo 9 ore di anossia. Tutte le determinazioni fanno riferimento a Bivalvi prelevati dal mare Adriatico nel periodo maggio-giugno.

Nella Tabella 1 vengono riportati i parametri cinetici della PK (Vmax e Km), per ognuna delle quattro specie, al tempo 0 e dopo incubazione anaerobica, riferiti ai grafici dell’attività enzimatica riportati in Figura 2. Valutando comparativamente nelle quattro specie in esame l’attività della PK ed i suoi parametri cinetici in condizioni aerobiche e dopo esposizione ad anaerobiosi sperimentale, è possibile stabilire un gradiente di inibizione enzimatica che è minima in Chamelea gallina e massima in Scapharca inaequivalvis. Si registra, infatti, una graduale diminuzione di affinità dell’enzima per il substrato e, quindi, un rallentamento della velocità di reazione enzimatica più evidente in Mytilus galloprovincialis e molto di più in Scapharca inaequivalvis.

Questo andamento è rilevato anche dalle variazioni dei parametri cinetici, come la Km, dopo esposizione anaerobica. In C. gallina, dopo 12 ore di anossia, la Km non presenta variazioni rilevanti, in T. philippinarum dopo 24 ore di anossia si assiste ad un aumento di 1,5 volte della Km ed in M. galloprovincialis dopo 9 ore di anossia, lo stesso parametro cinetico, indice dell’affinità dell’enzima per il substrato, aumenta di 2,6 volte. Molto differente, invece, è la situazione per la PK in S. inaequivalvis che, dopo 12 ore di anaerobiosi, presenta un notevole aumento del valore della Km di circa 6,4 volte rispetto a quello riscontrato in aerobiosi, questo è evidenziato anche dall’appiattimento della curva di attività in funzione del substrato (Figura 2).

In seguito, focalizzando ulteriori studi in Scapharca inaequivalvis, visto che i parametri cinetici presentavano variazioni più evidenti rispetto alle altre specie, e, partendo dal presupposto che i dati sopra riportati si riferivano al mese di giugno, si è valutata l’attività della PK nel M.A.P., al tempo 0 e dopo 12 ore di anaerobiosi, anche nei mesi di marzo ed aprile in modo da evidenziare eventuali variazioni stagionali delle risposte enzimatiche all’anaerobiosi. Anche in questi due mesi la PK in anossia ha presentato un aumento di Km nei confronti del substrato pari a circa 3,2 volte in marzo e 3,9 volte in aprile e, quindi, quantitativamente inferiore rispetto all’esposizione anossica condotta nel mese di giugno dove la Km presentava un aumento di circa 6,4 volte.

Per meglio valutare i tempi di risposta dei meccanismi di regolazione della PK all’insorgere di condizioni anossiche, si sono registrate le variazioni della sua attività nel M.A.P. di S. inaequivalvis nei mesi di marzo, aprile e giugno al tempo 0 ed a vari intervalli di incubazione anaerobica fino a 96 ore. Questo ha permesso di calcolare un parametro detto "PK ratio" (rapporto tra la attività enzimatica rilevata a concentrazioni di substrato molto basse e l’attività massima della reazione) il quale consente di osservare in modo più immediato la variazione dell’attività enzimatica in relazione all’anossia, e, secondo alcuni autori, può dare informazioni su eventuali meccanismi di fosforilazione della PK che la porterebbero ad assumere una forma enzimatica meno affine al substrato. Come si può osservare nel grafico che riporta i valori di "PK ratio" relativi ai 3 mesi in relazione alle ore di anossia (Figura 3), il valore cala più rapidamente negli esemplari del mese di giugno, infatti già dopo le prime 12 ore di anossia ha raggiunto un valore che rappresenta il 10% del controllo aerobico.

 

Discussione e conclusioni

Analizzando i parametri cinetici (Vmax e Km) della piruvato cinasi, uno degli enzimi chiave nella regolazione della glicolisi, nel muscolo adduttore posteriore delle quattro specie in esame sottoposte ad anossia a breve termine, si nota da un confronto dell’attività massima dell’enzima (Vmax) in condizioni aerobiche, come le due specie appartenenti alla famiglia dei Veneridi (Chamelea e Tapes), presentano un’attività più elevata rispetto a Mytilus e Scapharca (Tabella I); in ogni caso tutti i valori rientrano nell’intervallo riportato per i Bivalvi da Zammit et al. (1978). Per quanto riguarda l’affinità dell’enzima per il substrato il fosfoenolpiruvato (PEP), i valori di Km misurati in condizioni aerobiche variano da un minimo di 0,077 mM per Tapes ad un massimo di 0,39 mM per Mytilus ed anche questi rientrano nell’intervallo riportato per i Bivalvi compreso fra 0,05 mM e 0,65 mM (Isani, 1987).

In seguito ad esposizione anaerobica sono state osservate ulteriori differenze fra le specie in esame soprattutto a carico della Km: in C. gallina non subisce variazioni notevoli, mentre in T. philippinarum, M. galloprovincialis e S. inaequivalvis l’aumento della Km diventa sempre più netto indicando una diminuzione di affinità della PK per il substrato. Questo è apprezzabile anche dal confronto delle curve dell’attività enzimatica in funzione del PEP nelle quattro specie di Bivalvi considerate (Figura 2). Dall’andamento delle curve si può dedurre, inoltre, che il diverso grado di regolazione della PK nelle quattro specie si è dimostrato strettamente correlato con i differenti tempi di sopravvivenza in anossia.

È stato ampiamente dimostrato in studi precedenti (Brooks et al. 1991) che forse la strategia vincente per sopravvivere a lungo in mancanza di ossigeno è la capacità di ridurre l’intensità del metabolismo, raggiungendo uno stato che viene riferito come "letargo metabolico", caratterizzato da valori di riduzione che arrivano ad essere, nei casi estremi come Scapharca e Mytilus, il 2-5% del valore aerobico (Isani et al. 1989, De Zwaan et al. 1991; Brooks et al. 1991). I meccanismi di regolazione che sono alla base di questo fenomeno riguardano soprattutto l’inibizione dell’attività di alcuni enzimi chiave del metabolismo glucidico come glicogeno fosforilasi, fosfofruttocinasi e piruvato cinasi. La regolazione dell’attività di quest’ultimo enzima si rivela particolarmente importante anche perché la PK si trova a controllare un incrocio metabolico determinante nel metabolismo anaerobico. Il graduale aumento della Km per il substrato fosfoenolpiruvato fa sì che questo intermedio metabolico venga reso disponibile in maggiori concentrazioni per l’enzima fosfoenolpiruvato carbossicinasi (PEPCK), il quale compete con la PK per lo stesso substrato (PEP) e catalizza la via alternativa che porta alla formazione di succinato e propionato e ad una maggiore resa in ATP. Quindi, senza dubbio, la maggiore inibizione della PK anaerobica in Scapharca e Mytilus è collegabile con la più intensa riduzione della domanda energetica e con la maggiore sopravvivenza di queste due specie, in anaerobiosi, rispetto a Chamelea e Tapes.

Dai risultati ottenuti sottoponendo esemplari di S. inaequivalvis ad un’anossia a breve termine in tre diversi periodi dell’anno (marzo, aprile e giugno) sono emerse ulteriori differenze nella regolazione della piruvato cinasi. In particolare, in questa specie, il diverso aumento della Km in relazione al mese di osservazione fa supporre l’esistenza di una variabilità legata a fattori stagionali, come ad esempio temperature diverse, in accordo con quanto osservato per la PK nel mantello di Mytilus edulis da Livingstone (1975), in cui si registravano variazioni stagionali di Km, con valori più alti in estate e più bassi in primavera.

Si potrebbe, inoltre, ipotizzare una variabilità nell’affinità dell’enzima per il substrato legata a variazioni della quantità di glicogeno presente nel tessuto: in quanto in giugno la quantità di glicogeno è minima in corrispondenza della fase di massima maturità delle gonadi (Cattani et al. 1986; Isani, 1987). Quindi la diminuzione di affinità dell’enzima per il substrato fosfoenolpiruvato che deriva dalla degradazione del glicogeno potrebbe calare dai mesi primaverili ai mesi estivi in concomitanza con la diminuzione delle riserve di glicogeno.

La variabilità nella regolazione enzimatica legata a fattori stagionali si può osservare anche nel grafico che riporta i valori di "PK ratio" relativi ai mesi di marzo, aprile e giugno in esemplari di Scapharca sottoposti ad anaerobiosi prolungata fino a 96 ore. Dopo 24 ore di anossia il valore della "PK ratio", nei mesi di marzo ed aprile, è di poco superiore al 25% del valore di controllo, pari ad una diminuzione della velocità della reazione enzimatica di circa quattro volte. In giugno, invece, si registra una diminuzione più netta in quanto dopo 24 ore il rapporto è circa il 7% del valore di controllo, pari ad un calo di attività di circa 14 volte (Figura 3).

Le diverse condizioni ambientali, anche nel caso di anaerobiosi prolungata, sembrano quindi condizionare l’attività della PK come osservato anche da Holwerda et al. (1984) in studi condotti su mitilo. In studi successivi condotti sempre da Holwerda et al. (1989) su Mytilus edulis veniva avanzata l’ipotesi di un’inibizione dell’attività della PK legata a meccanismi di fosforilazione-defosforilazione dell’enzima. I dati rilevati in Scapharca, nel presente studio, molto simili a quelli riportati nel mitilo, sarebbero quindi a favore di una probabile fosforilazione della PK anche in questa specie. Questo meccanismo di regolazione, che entrerebbe in funzione già durante le prime ore di anossia, soprattutto nei mesi più caldi, favorirebbe il rallentamento metabolico e il funzionamento della via alternativa catalizzata dall’enzima PEPCK che porta ad una maggiore resa energetica, come riportato sopra.

Nel presente lavoro si sono volute indagare le variazioni dell’attività enzimatica della piruvato cinasi, un enzima chiave nella regolazione del catabolismo glucidico. Si è fatta una valutazione comparata dell’attività della piruvato cinasi nel muscolo adduttore posteriore di Chamelea gallina, Tapes philippinarum, Mytilus galloprovincialis e Scapharca inaequivalvis sottoposti ad incubazione anaerobica e sono state messe in evidenza interessanti differenze che possono essere riassunte nei seguenti quattro punti conclusivi:

1) La capacità di ridurre la velocità della reazione enzimatica fin dalle prime ore di esposizione anaerobica, viene premiata con maggiori tempi di sopravvivenza;

2) Esistono specie più o meno adatte ad un metabolismo di tipo anaerobico: specie come Chamelea e Tapes che sono meno efficienti nel ridurre l’attività enzimatica e, quindi, l’attività metabolica, sopravvivono meno rispetto a specie come Mytilus e Scapharca che riducono l’attività enzimatica fin dalle prime ore di anossia;

3) In particolare Scapharca presenta un metabolismo anaerobico particolarmente flessibile, in quanto sin dalle prime ore, si ha una brusca riduzione della domanda energetica, fino ad una situazione nelle ore successive di "letargo metabolico", dimostrando una serie di strategie vincenti per superare situazioni di stress anossico, tra le quali si possono ipotizzare meccanismi di fosforilazione volti ad ottenere forme enzimatiche meno attive;

4) In Scapharca la riduzione dell’attività della piruvato cinasi in anossia sembra legata a variazioni delle condizioni ambientali e quindi alla stagionalità: nei mesi più caldi (giugno) l’attività dell’enzima cala in modo più evidente ed in tempi più brevi rispetto ai mesi primaverili (marzo-aprile).

Infine, vorrei sottolineare le ricadute pratiche che questi studi sul metabolismo anaerobico possono assumere. Le specie indagate, tranne Scapharca, svolgono un ruolo economico importante in quanto oggetto di pesca o di allevamento lungo le coste italiane ed, in quanto specie sessili, vengono spesso a trovarsi esposte ad anossia nell’ambiente in cui vivono. L’approfondimento, quindi, sia delle cause che portano al verificarsi di questa condizione di stress ambientale, sia delle risposte metaboliche che si innescano negli animali sottoposti ad anossia, potrebbero essere di fondamentale importanza per arricchire le conoscenze tecniche alla base di una corretta conduzione degli allevamenti.

Maria Luisa Missiroli

 

Bibliografia

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